Khối phổ liên kết ngang: Câu hỏi thường gặp và các giải pháp đã được chứng minh

Khối phổ liên kết ngang đã nhanh chóng trưởng thành từ một kỹ thuật chuyên môn thành nền tảng của proteomics cấu trúc và lập bản đồ tương tác. Các nhà đổi mới ban đầu bao gồm Ruedi Aebersold, Juri Rappsilber, Andrea Sinz và các cộng tác viên đã chỉ ra cách XL-MS có thể xác nhận các mô hình cryo-EM, giải quyết tổ chức của các máy đại phân tử lớn và phơi bày các tiếp xúc protein - protein thoáng qua hiếm khi tồn tại sau quá trình tinh chế. Dựa trên đà này, hệ sinh thái tích hợp gồm các dịch vụ, thiết bị và vật tư tiêu hao của chúng tôi cung cấp quy trình làm việc có thể tái tạo, thông lượng cao cho Khối phổ liên kết chéo - từ lập kế hoạch mẫu đến giải thích dữ liệu - được thiết kế để đáp ứng nhu cầu khám phá hiện đại. Khối phổ liên kết ngang (XL-MS) đã phát triển thành một công cụ cốt lõi để phân tích protein cấu trúc và tương tác. Bằng cách nắm bắt các hạn chế không gian giữa các dư lượng, XL-MS bổ sung cryo-EM và tinh thể học và tiết lộ các tương tác protein-protein thoáng qua thường thoát khỏi các phương pháp dựa trên tinh chế.

(Khối phổ liên kết ngang để điều tra cấu trúc protein

và Tương tác protein-protein - Phương pháp cho tất cả các mùa)

Khối phổ liên kết ngang thực sự nắm bắt được điều gì

Khối phổ liên kết ngang (còn được gọi là liên kết ngang hóa học kết hợp với khối phổ, CL-MS hoặc XL-MS) sử dụng thuốc thử lưỡng chức năng để liên kết cộng hóa trị các axit amin nằm trong một cửa sổ không gian xác định. Sau khi liên kết ngang, quá trình phân hủy enzym nhắm mục tiêu tạo ra hỗn hợp peptide tuyến tính và liên kết ngang. Sau đó, khối phổ phát hiện và xác định các loài liên kết ngang này, chuyển chúng thành các ràng buộc về khoảng cách, đối tác tương tác và thông tin cụ thể của địa điểm có thể được đưa vào các mô hình cấu trúc. Bởi vì XL-MS cung cấp các hạn chế có nguồn gốc từ proteomics, nó bổ sung cho kính hiển vi điện tử lạnh và tinh thể học tia X bằng cách nối đất mật độ mơ hồ và tinh chỉnh các giao diện.

Ngoài sức mạnh tích hợp, Khối phổ liên kết ngang còn mang lại những lợi thế thiết thực: nó mở rộng quy mô đến thông lượng cao, hỗ trợ các ứng dụng nội bào và không yêu cầu thẻ tổng hợp di truyền hoặc dán nhãn hóa học đặc biệt. Điều quan trọng là liên kết chéo cộng hóa trị "đóng băng" các tiếp xúc yếu hoặc thoáng qua, làm cho XL-MS trở thành một đối tác mạnh mẽ để tinh chế ái lực hoặc MS tự nhiên khi mục tiêu là tiết lộ các tương tác mà nếu không sẽ tiêu tan.

Tại sao việc nhận con nuôi bị trì hoãn: Điểm đau dai dẳng

Ngay cả với những lợi ích rõ ràng, một số rào cản vẫn cản trở việc triển khai thường xuyên:

-Làm giàu và khả năng phát hiện. Peptide liên kết ngang thường hiếm so với peptide tuyến tính. Nếu không làm giàu hoặc phân đoạn một cách chu đáo, tỷ lệ nhận dạng sẽ giảm và phạm vi bao phủ của các trang web có thể liên kết trở nên chắp vá.

-Chấm điểm và xác nhận phức tạp. Khối lượng tiền chất tổng hợp và các mẫu phân mảnh phức tạp làm phức tạp việc giải thích phổ. Kiểm soát tỷ lệ phát hiện sai (FDR) đối với các cặp liên kết chéo yêu cầu chấm điểm nhận biết trang web và ngưỡng được điều chỉnh cẩn thận, nếu không các liên kết giả có thể lọt qua.

-Tối ưu hóa học. Lựa chọn liên kết chéo và vấn đề liều lượng. Liên kết quá mức có thể làm gián đoạn kiến trúc gốc; Liên kết chéo dưới tạo ra bản đồ thưa thớt. Liên kết ngang trong tế bào làm tăng độ phức tạp của ma trận có thể làm giảm sự phục hồi peptide.

-Thiết kế phương pháp dụng cụ. Độ nhạy phải được cân bằng với chất lượng phân mảnh. Nếu bạn chỉ sử dụng HCD, độ bao phủ phân đoạn có thể không đồng đều; ETD / EThcD cần hiệu chuẩn để đảm bảo các ion hữu ích được thu hồi cho nhiều cặp peptide khác nhau.

-Phần mềm và tiêu chuẩn phân mảnh. Các công cụ và định dạng báo cáo không đồng nhất gây khó khăn cho việc so sánh kết quả giữa các dự án hoặc hợp nhất đầu ra XL-MS với cơ sở dữ liệu cấu trúc để mô hình hóa tích hợp.

Câu hỏi thường gặp thực tế và các giải pháp đã được chứng minh cho phép đo khối phổ liên kết ngang

• Tôi nên chọn một cây thánh giá như thế nào-liên kết cho hệ thống của tôi?

• Khớp chiều dài miếng đệm với khoảng cách tương tác dự kiến và chọn các nhóm phản ứng phù hợp với dư lượng trội (hóa chất nhắm mục tiêu lysine là phổ biến).

• Nồng độ chất liên kết ngang chuẩn độ thí điểm và thời gian phản ứng để ngăn chặn liên kết ngang.

• Trong các ma trận phức tạp, hãy chọn các hóa chất có phản ứng đặc trưng rõ ràng và các giao thức làm nguội đã được xác nhận.

• Làm thế nào tôi có thể cải thiện khả năng phục hồi của cây thánh giá-peptide liên kết?

• Sử dụng quy trình tiêu hóa tuần tự (ví dụ: Lys-C sau đó là trypsin) để mở rộng ranh giới peptide và giảm sự phân chia bị bỏ lỡ.

• Sử dụng làm giàu ở mức peptide cùng với phân đoạn trực giao để tập trung các loài liên kết ngang trước LC-MS.

• LC nào-Cài đặt MS tăng tỷ lệ nhận dạng? (Không có phương pháp LC-MS nào phù hợp với tất cả các peptide liên kết ngang. Tối ưu hóa phương thức nên được coi là một phần của quy trình làm việc XL-MS, không phải thiết lập một lần.)

• Có được MS / MS độ phân giải cao và điều chỉnh năng lượng va chạm để cân bằng xương sống và phân mảnh liên kết ngang.

• Xem xét phân mảnh hỗn hợp (HCD bổ sung ETD hoặc EThcD) để có độ bao phủ trình tự phong phú hơn của các cặp liên kết ngang.

• Làm cách nào để kiểm soát các phát hiện sai?

• Áp dụng các phương pháp tiếp cận mục tiêu - mồi nhử phù hợp với các tìm kiếm liên kết chéo và thực thi các bộ lọc điểm delta, cấp trang web và loại liên kết.

• Xác nhận các liên kết quan trọng giữa các bản sao sinh học và kỹ thuật và kiểm tra chéo với mật độ cryo-EM hoặc các xét nghiệm sinh hóa trực giao.

• Khối phổ liên kết ngang có thể ghi lại các tương tác thoáng qua trong tế bào sống không?

• Có - liên kết chéo được thực hiện bên trong các tế bào bảo tồn các tương tác thoáng qua. Tối ưu hóa quá trình làm nguội và ly giải cho tính toàn vẹn của phụ gia và sử dụng làm giàu để quản lý hiệu ứng ma trận trước MS.

• Làm cách nào để tích hợp XL-MS với cryo-EM hoặc X-tia?

• Cung cấp giới hạn khoảng cách cụ thể của trình liên kết và số liệu độ tin cậy. Sử dụng các hạn chế XL-MS để định hướng miền, xác nhận giao diện và gắn cờ các vùng bất hòa để tinh chỉnh mô hình.

(Phản ứng của các este NHS phản ứng amin, được ví dụ cho BS3 (bảng điều khiển phía trên).

Các sản phẩm phản ứng với protein bao gồm liên kết chéo Intrapeptide (Loại 1; Trái),

Liên kết chéo Interpeptide (Loại 2; giữa),

và Liên kết chéo "Ngõ cụt" hoặc "Liên kết đơn" (Loại 0; Phải))

Ngăn xếp sản phẩm và dịch vụ tích hợp giúp tăng tốc XL-MS

Chúng tôi cung cấp một Dịch vụ XL-MS đầu cuối, bao gồm thiết kế thí nghiệm, tối ưu hóa hóa học, chuẩn bị mẫu, thu thập LC-MS và giải thích dữ liệu. Cách tiếp cận tích hợp này giảm thiểu thử và sai, giảm phát hiện sai và rút ngắn lộ trình từ thử nghiệm thí điểm đến kết quả có thể xuất bản. Khách hàng có thể gửi các mẫu liên kết chéo trước hoặc đồng thiết kế quy trình làm việc với nhóm của chúng tôi ngay từ đầu.

• Tại sao các giải pháp bộ gen và thiết bị phòng thí nghiệm của chúng tôi tăng cường XL-MS?

XL-MS được hưởng lợi từ việc chuẩn bị mẫu ngược dòng ổn định và phát hiện hạ nguồn mạnh mẽ. Chúng tôi cung cấp các thiết bị tiên tiến, thuốc thử chất lượng cao và vật tư tiêu hao hỗ trợ Khối phổ liên kết ngang và các đường ống omics liên quan trong môi trường học thuật, lâm sàng và công nghiệp. Được thúc đẩy bởi hiệu quả và độ chính xác, quy trình làm việc của chúng tôi hỗ trợ các nghiên cứu thông lượng cao với chất lượng dữ liệu nhất quán - điều kiện lý tưởng để giải thích tự tin quang phổ peptide liên kết ngang.

• Hồ sơ tương tác ChIP-Seq và Chromatin

Khi các dự án thẩm vấn các tiếp xúc protein - nhiễm sắc cùng với Khối phổ liên kết ngang, ChIP-seq bổ sung bối cảnh bộ gen cụ thể của locus. Bằng cách lập bản đồ yếu tố phiên mã và các vị trí liên kết histone trên toàn bộ bộ gen, ChIP-seq giúp kết nối các hạn chế XL-MS với cảnh quan điều hòa chức năng, củng cố các kết luận cơ học và hướng dẫn các giả thuyết cho các thí nghiệm tiếp theo.

• Hỗ trợ bộ gen và chuẩn bị mẫu

Longlight tập trung vào sinh học phân tử và chẩn đoán phân tử với danh mục các dụng cụ và thuốc thử liên quan đến NGS, bao gồm các giải pháp siêu âm tập trung để chuẩn bị thư viện chính xác. Những khả năng này ổn định chất lượng mẫu ngược dòng - một yếu tố quyết định thành công thường bị bỏ qua - để Phép đo khối phổ liên kết chéo tạo ra kết quả có thể giải thích, tái tạo trên các lô và dự án.

• Vật tư tiêu hao và bộ dụng cụ làm giảm sự thay đổi

Chúng tôi cung cấp gel agarose đúc sẵn, chất nhặt rác axit nucleic, ống Qubit, bộ dụng cụ chiết xuất axit nucleic và bộ dụng cụ chuẩn bị thư viện. Sử dụng vật tư tiêu hao thông thường và quy trình vận hành tiêu chuẩn nghiêm ngặt giúp giảm sự thay đổi hàng ngày, giúp các nhóm mang lại hiệu suất XL-MS ổn định qua các phép đo lặp đi lặp lại và tích hợp đa omics.

• Các đề xuất được sắp xếp hợp lý để ngăn chặn các lỗi phổ biến

• Chạy chuẩn độ thí điểm để điều chỉnh nồng độ thuốc thử và thời gian phản ứng trên mỗi ma trận.

• Sử dụng quy trình làm việc protease được tiêu chuẩn hóa và làm giàu ở mức peptide để tăng năng suất peptide liên kết ngang.

• Giữ các phiên bản phương thức LC - MS được ghi lại và khi thích hợp, ưu tiên phân mảnh HCD / ETD hoặc EThcD kết hợp có độ phân giải cao.

• Đặt các bộ lọc điểm số, điểm delta và cấp trang web nghiêm ngặt, đồng thời tái tạo các liên kết ưu tiên trong các bản sao kỹ thuật và sinh học độc lập.

• Kết hợp Khối phổ liên kết ngang với cryo-EM hoặc tia X và tiết lộ giới hạn khoảng cách cụ thể của liên kết và các chỉ số độ tin cậy để mô hình tích hợp.

Từ thí điểm đến quy mô: Bước tiếp theo của bạn

Lập kế hoạch khối phổ liên kết chéo để lập bản đồ tương tác protein, xác nhận cấu trúc hoặc mô hình tích hợp? Hợp tác với các chuyên gia của chúng tôi để thiết kế quy trình làm việc đáng tin cậy, thông lượng cao được tối ưu hóa cho mục tiêu của bạn. Chúng tôi sẽ tư vấn về lựa chọn chất liên kết chéo, tổ chức gửi mẫu và thực hiện tiêu hóa, làm giàu, thu thập MS và phân tích dữ liệu. Mong đợi một báo cáo ngắn gọn với thông tin chi tiết hữu ích. Hợp tác với chúng tôi để cắt giảm rủi ro, khắc phục các nút thắt cổ chai phổ biến và nâng tầm XL-MS từ những thí điểm ban đầu thành khám phá đáng tin cậy hàng ngày.