Bộ đệm điện di siêu nhanh: Gel DNA nhanh hơn mà không mất độ rõ nét

Mặc dù điện di gel agarose đơn giản và đáng tin cậy, thời gian cho điện di truyền thống đôi khi là yếu tố giới hạn trong phòng thí nghiệm sinh học phân tử bận rộn. Nếu phòng thí nghiệm thực hiện nhiều phản ứng PCR, tiêu hóa hạn chế hoặc nhân bản mẫu mỗi ngày, một lần chạy 30 phút có thể trở thành nút thắt cổ chai lớn khi nhiều gel được xử lý mỗi ngày.

Bộ đệm điện di siêu nhanh được thiết kế với cường độ ion thấp hơn, làm giảm độ dẫn điện và dòng điện ở một cường độ trường điện nhất định và do đó giới hạn nhiệt Joule. Điều này cho phép sử dụng cường độ trường cao hơn trong điều kiện đã được xác thực, rút ngắn thời gian tách trong khi vẫn giữ được độ phân giải dải hữu ích.

Siêu Nhanh điện di Buffer—Đó là gì?

Bộ đệm điện di siêu nhanh là bộ đệm điện di cường độ ion thấp, được tối ưu hóa để tách nhanh các đoạn DNA trong gel agarose. Cung cấp các ion cần thiết cho độ dẫn điện và điều kiện hóa học trong quá trình di chuyển.

Độ bền ion của bộ đệm này thấp hơn hầu hết các bộ đệm truyền thống, do đó lượng nhiệt được tạo ra ít hơn ở một điều kiện hoạt động nhất định do dòng điện. Điều này cho phép sử dụng gradient điện áp cao hơn trong phòng thí nghiệm và rút ngắn thời gian chạy.

Longlight's Bộ đệm chạy siêu nhanh 50X được cung cấp dưới dạng dung dịch cô đặc, giúp rút ngắn thời gian tách từ 30 phút thông thường xuống còn khoảng 5-10 phút tùy theo điều kiện khuyến nghị.

Lý do tại sao thấp hơn Sức mạnh ionic có thể tăng tốc độ chạy?

DNA có điện tích âm và di chuyển về phía điện cực dương trong trường điện. Trường điện càng cao thì DNA di chuyển càng nhanh, tuy nhiên, bộ đệm thông thường có thể tạo ra nhiệt đáng kể ở trường điện cao.

Quá nhiệt có thể khiến agarose bị chảy chảy, dẫn đến đường bị cong, dải cong hoặc làm hỏng thiết bị điện di. Bộ đệm có cường độ ion thấp dẫn đến dòng điện thấp hơn; sinh ra ít nhiệt hơn, giúp hoạt động ở điện áp cao trở nên khả thi hơn.

Điều này không có nghĩa là điện áp có thể được tăng lên vô thời hạn. Kích thước gel, độ sâu bộ đệm, thiết kế buồng, nhiệt độ môi trường và dung lượng nguồn điện vẫn tiếp tục ảnh hưởng đến quá trình chạy.

sẽ nhanh hơn điện di Kết quả là độ phân giải thấp hơn?

Khi bộ đệm, nồng độ agarose, điện áp và khoảng cách chạy phù hợp với mẫu, có thể đạt được sự tách tốt với một lần chạy nhanh. Các điều kiện thường không được kiểm tra khi chuyển một phương pháp, dẫn đến độ phân giải kém.

Để các mảnh có thể tách ra, chúng phải có khoảng cách di chuyển đủ lớn nếu kích thước gần nhau. Nếu dòng chảy bị dừng quá sớm, chúng có thể bị nén lại, ngay cả khi thuốc nhuộm theo dõi đã di chuyển, gần các giếng.

Các phòng thí nghiệm cần nhận biết sự khác biệt giữa phân tích để xác định sự có mặt hay vắng mặt và gel phân tích độ phân giải cao. Loại đầu tiên có thể cần thời gian dùng gel ngắn hơn, loại thứ hai có thể cần thời gian gel lâu hơn hoặc điện áp thấp hơn một chút.

Cách chuẩn bị bộ đệm làm việc 1X từ cô đặc 50X?

50 X cô đặc nên được pha loãng thành dung dịch làm việc 1 lần. Ví dụ, để tạo 1 L dung dịch làm việc 1X, trộn 20mL cô đặc 50X với 980ml nước cất hoặc nước khử khoáng.

Lắc đều trước khi đúc hoặc đổ đầy buồng. Đối với cả việc chuẩn bị gel agarose và bình chạy, hãy sử dụng cùng một hỗn hợp 1X để duy trì độ dẫn điện nhất quán của hệ thống.

Không pha loãng bộ đệm dưới nồng độ làm việc khuyến nghị để giảm dòng điện thêm. Đệm yếu và/hoặc mẫu dải không đều có thể xảy ra do nồng độ không đúng, dẫn đến di chuyển bất thường.

Đó là gì Đúng vậy Điện áp cần đặt?

Điện áp nên được xác định dựa trên chiều dài gel hiệu dụng, chứ không chỉ chọn từ bộ nguồn quen thuộc. Longlight khuyến nghị sử dụng khoảng 25–30 V/cm chiều dài gel với bộ đệm chạy nhanh.

Nhưng thiết lập cuối cùng cũng nên xem xét buồng điện di và loại nhiệt độ gel và đệm. Điện áp cuối cùng cũng nên tính đến chiều dài gel, tải mẫu, thiết kế buồng và nhiệt độ đệm.

Nguồn điện cần ổn định ở mức mong muốn. Nguồn điện Nguồn điện điện di EP-600 do Longlight sản xuất được thiết kế để cung cấp nguồn điện di ổn định cho phòng thí nghiệm.

Gel gì Điều kiện Chưa thay đổi?

Đệm không thể vượt qua việc sử dụng nồng độ agarose không phù hợp. Nồng độ agarose thấp sẽ có xu hướng hỗ trợ các mảnh phân tử có trọng lượng cao hơn, và nồng độ agarose càng cao thì việc tách các đoạn DNA nhỏ hơn càng tốt.

Độ dày của gel cũng rất quan trọng. Gel dày có thể mất nhiều thời gian hơn để nhuộm và có thể có nhiệt cao hơn. Làm sạch hình thành giếng và lấy mẫu mà không làm hỏng các mép.

Buồng ngang tương thích cho phép cân bằng điều kiện điện. Các Hệ thống gel ngang HE-50 Tương thích với nhiều hệ thống gel và có thiết kế buồng tiêu thụ buffer thấp.

Nên sử dụng phương pháp nhuộm và hình dung nào cho DNA?

Tùy thuộc vào sản phẩm và quy trình, có thể sử dụng thuốc nhuộm axit nucleic trong quá trình chuẩn bị gel hoặc được áp dụng sau khi điện di. Khi so sánh bộ đệm nhanh với phương pháp nhuộm hiện có, phương pháp nhuộm phải giống nhau.

Các buổi chạy rất ngắn có thể ảnh hưởng đến cảm nhận về cường độ nhuộm, đặc biệt nếu các dải chạy quãng đường ngắn. Điều quan trọng là phải điều chỉnh mức phơi sáng, do đó, theo những điều trên, không nên sao chép phơi sáng tự động từ các lần chạy truyền thống.

LongLight's RedView Thuốc nhuộm axit nucleic có thể được sử dụng để trực quan hóa DNA và RNA trong gel agarose và polyacrylamide và hoạt động với thiết bị hình ảnh phổ biến.

Có phải vậy không? có thể để lấy DNA sau một lần chạy nhanh?

Có, miễn là lớp đệm và màu không ảnh hưởng đến việc chiết xuất gel và các phản ứng sau. Theo Longlight, 50X Super Fast Running Buffer không ảnh hưởng đến việc chiết xuất hoặc liên kết gel DNA.

Giảm thiểu tiếp xúc không cần thiết với tia UV và loại bỏ một lát gel nhỏ nhất có thể để phục hồi tốt nhất. Dải nên được giữ riêng biệt để đủ rõ ràng để không có sản phẩm bên cạnh bị bao phủ.

Khi xác thực một phương pháp là để nhân bản, giải trình tự hoặc các quy trình nhạy cảm khác, hãy đánh giá sản lượng, độ tinh khiết và hiệu suất của DNA thu hồi.

Khi nào nên thay đổi bộ đệm đang chạy?

Một số bộ đệm có thể tái sử dụng nhưng việc tái sử dụng cần được kiểm soát chứ không chỉ dựa trên vẻ ngoài. Với các lần chạy lặp lại, nhiệt độ, phân bố ion và hiệu suất bộ đệm có thể thay đổi.

Nếu di chuyển chậm lại, các dải không có hình dạng như mong đợi hoặc dung dịch bị nhiễm bẩn, hãy thay thế bộ đệm. Một lý do khác để kiểm tra bộ đệm là nhiệt độ phòng cao, và sau các lần chạy nhanh liên tiếp.

Nếu mẫu quan trọng hoặc có đầu vào thấp, nên sử dụng bộ đệm làm việc mới để tránh sự thay đổi không cần thiết.

Các bước thích hợp để Phòng thí nghiệm xác thực Công tắc là gì?

Sử dụng thang DNA và mẫu đã biết. Sử dụng cùng phương pháp nồng độ gel, thể tích mẫu và phương pháp nhuộm trên bộ đệm hiện có và bộ đệm siêu nhanh rồi chạy song song.

Khớp thời gian chạy, hình dạng dải, sự tách rời các mảnh gần nhau và tính nhất quán di chuyển cũng như chất lượng hình ảnh. Khi việc chiết xuất gel tham gia vào quy trình làm việc, hãy đánh giá hiệu suất chiết xuất gel và một phản ứng tiếp theo.

Sau khi được chấp nhận, hãy ghi lại sự pha loãng, độ dốc điện áp, kích thước gel, độ dài quá trình và cách gel được nhuộm cũng như số lần sử dụng bộ đệm. Longlight Hóa chất và vật tư tiêu hao tổng quát được thiết kế để hỗ trợ các ứng dụng genomics và sinh học phân tử thông thường.

Kết thúc

Bộ đệm điện di siêu nhanh có thể biến phân tích gel agarose thành kiểm tra chất lượng nhanh chóng. Ưu điểm là cho phép cường độ ion thấp hơn nhưng vẫn tăng cường điện trường sử dụng được.

Tuy nhiên, tất cả các khía cạnh của chuẩn bị 1X, so sánh gel và bộ đệm chạy, nồng độ agarose và kiểm soát nhiệt độ vẫn rất quan trọng để đảm bảo kết quả đáng tin cậy. Xác thực ngắn gọn bên cạnh cho phép phòng thí nghiệm rút ngắn thời gian chạy mà không làm mất khả năng phân tách dải tần có thể hiểu được.

Câu hỏi thường gặp

Q1. Có thể sử dụng bộ đệm điện di siêu nhanh với gel DNA không?

Có. Được thiết kế để tách nhanh DNA trong gel agarose. Người dùng được khuyến nghị kiểm tra sự tương thích của buồng gel, nhuộm và quy trình tiếp theo.

Q2. Bộ đệm 50X đã sẵn sàng sử dụng chưa?

Không. Một loại cô đặc 50X phải được pha loãng đến 1X trước khi chuẩn bị gel hoặc điện di. Sử dụng trực tiếp cô đặc sẽ dẫn đến độ bền ion và độ dẫn điện quá cao, dẫn đến dòng điện và nhiệt quá mức trong quá trình điện di.

Q3. Có dùng cùng loại đệm để quăng và để chạy gel không?

Đúng vậy, cùng một lô buffer làm việc 1X được khuyến nghị cho cả hai. Điều này giúp duy trì độ bền buffer trong toàn bộ hệ thống gel.

Q4. Gel có nóng lên nếu điện áp tăng lên không?

Nếu không đệm đủ, điện áp hoặc điều kiện buồng có thể không phù hợp. Đối với nhiều lần chạy và/hoặc phòng thí nghiệm nóng, hãy theo dõi nhiệt độ đệm.

Q5. Có thể thu hồi DNA từ tách điện di nhanh để liên kết không?

Có, nếu sử dụng nhuộm và đệm phù hợp. Việc xác nhận ban đầu của phòng thí nghiệm nên bao gồm hiệu suất phục hồi và gắn bó.