Hệ thống phân mảnh DNA siêu âm: Điều gì làm cho việc cắt DNA có thể tái tạo được?

Phá vỡ DNA không phải chuyện lớn.

Phần quan trọng là phân tách nó thành một phân bố mảnh hữu ích và có thể lặp lại, từ mẫu này sang mẫu khác, từ ngày này sang ngày khác.

Do đó, khả năng cắt DNA bộ gen không nên là tiêu chí duy nhất được sử dụng để đánh giá hệ thống phân mảnh DNA siêu âm. Thay vào đó, câu hỏi đối với phòng thí nghiệm NGS là liệu một mẫu có thể được xác định rõ ràng và đặt vào thiết bị hôm nay, tuần tới, hoặc trong tay phòng thí nghiệm khác mà vẫn tiến tới chuẩn bị thư viện mà không cần phải suy nghĩ lại toàn bộ quy trình hay không.

Thay vì là một quá trình siêu âm độc lập, phân mảnh âm thanh có kiểm soát là một phần trong quá trình của Longlight Cắt DNA / RNA quy trình làm việc, được thiết kế để chuẩn bị mẫu NGS. Sự phân biệt này có thể hữu ích khi thiết kế một kỹ thuật cần được điều chỉnh cho công việc phòng thí nghiệm hàng ngày.

Luôn bắt đầu với Fragment Profile chứ KHÔNG phải cài đặt nguồn.

Mục tiêu của thí nghiệm không phải là thiết lập thiết bị.

Mục tiêu là số lượng DNA được loại bỏ khỏi ống.

Định nghĩa những gì được mong đợi sau quy trình làm việc thư viện là điểm đầu tiên để bắt đầu và sau đó làm ngược lại giao thức âm học. Một thiết lập tạo ra phân phối có lợi cho một mảng DNA không nên được coi là giao thức phổ quát cho các mảng khác.

Điều này đặc biệt quan trọng trong trường hợp chuyển giao phương pháp. Rất dễ để sao chép một chương trình siêu âm từ một thí nghiệm trước đó và coi như xong việc. Nồng độ mẫu, thể tích mẫu, tình trạng DNA, loại ống và lịch sử xử lý đều là một phần của phương pháp thực tế.

Do đó, hệ thống phải được xác thực dựa trên mẫu thực tế, thay vì dựa trên một con số hấp dẫn hiển thị trên màn hình đồng hồ đo.

DNA đến với Sonicator với một quá khứ.

"DNA bộ gen" có trong hai ống không nhất thiết là đầu vào bằng nhau.

Người ta có thể bao gồm DNA trọng lượng phân tử cao từ một lần chiết xuất sạch. Người khác có thể đã trải qua quá trình lưu trữ, xử lý nhiều lần hoặc quá trình lọc lưu trữ trước khi bắt đầu phân mảnh.

Điều này quan trọng vì bước cắt là bước giữa trong bước lớn hơn.

Phòng thí nghiệm nên xác định trước các biến số có thể kiểm soát được (thể tích mẫu, phạm vi nồng độ DNA, loại vật chứa, điều kiện nhiệt độ và quy trình xử lý) trước khi tối ưu hóa quy trình phân mảnh DNA siêu âm. Nếu không, lỗi có thể xuất hiện ở nhiều bước phía trước như một vấn đề thiết bị rõ ràng.

Trong hầu hết các trường hợp siêu âm hội tụ, năng lượng được tác động lên mục tiêu.

Phương pháp siêu âm truyền thống thường khiến các nhà nghiên cứu tập trung vào lượng siêu âm được tạo ra. Câu hỏi khác về siêu âm tập trung là: Năng lượng âm thanh đó đang đi đâu?

Hệ thống BoFU của Longlight không yêu cầu đầu dò được đưa vào mẫu sinh học, mà cần các khía cạnh năng lượng âm học tập trung trong môi trường âm học. Sử dụng chế độ xử lý không tiếp xúc và kiểm soát nhiệt độ tích hợp, Máy siêu âm tập trung BoFU-100 được cho là được thiết kế cho việc cắt DNA, RNA và chromatin, cũng như phân mảnh bộ gen, cho NGS.

Cách bố trí không tiếp xúc, đóng kín này thuận tiện cho việc phân mảnh DNA vì mẫu không cần tiếp xúc trực tiếp với đầu dò siêu âm. Nó cũng giảm thiểu các biến tiếp xúc mẫu và quá trình làm sạch mà giao thức sẽ được tích hợp trong giao thức.

Không nhất thiết là "thêm siêu âm".

Đó là việc cung cấp siêu âm được kiểm soát tốt hơn.

Nhiệt độ là một phần của Phương pháp Phân mảnh!

Nhiệt độ là một yếu tố dễ bỏ qua vì nó không phải là biến riêng biệt trong file giải trình tự cuối cùng.

Tuy nhiên, điều kiện nhiệt trong quá trình siêu âm là một phần của môi trường xử lý mẫu. Nếu lịch sử nhiệt độ khác nhau ở mỗi lần chạy so với lần trước, thì giao thức sẽ được tái tạo khác nhau.

Đó là lý do tại sao việc nghĩ đến quản lý nhiệt độ sớm hơn trong quá trình thiết kế trước khi sử dụng âm học, chứ không phải như một thiết bị.

Thiết kế máy siêu âm tập trung của Longlight bao gồm xử lý mẫu nhiệt độ thấp, nhiệt độ không đổi và cảm biến tích hợp để kiểm soát nhiệt sinh ra trong quá trình xử lý siêu âm.

Đối với phát triển phương pháp, tức là ghi lại các điều kiện liên quan đến nhiệt độ, nghiêm túc như chương trình siêu âm.

"Tái lập" có nghĩa là gì với thông lượng?

Những gì diễn ra suôn sẻ với một ống sẽ trở nên phiền phức nếu có 20 hoặc 40 mẫu đến trước bữa trưa.

Vậy nên lúc đó vấn đề là do thông lượng.

Mẫu có thể được giữ trong các khoảng thời gian khác nhau trước khi xử lý. Các thiết lập có thể được nhập nhiều lần bởi người vận hành. Có thể có sự khác biệt giữa các loại mẫu vật. Quy trình làm việc như vậy, trong đó có nhiều công việc thủ công lặp đi lặp lại, có thể gây ra sự biến động ngay cả khi công nghệ âm học tự nó ổn định.

Longlight's Máy siêu âm hội tụ BoFU-800 có khả năng xử lý từ 1-8 mẫu, với các điều kiện có thể tối ưu hóa, và các thiết lập lô có thể áp dụng nếu nhiều mẫu được xử lý đồng thời.

Thuộc tính Máy siêu âm tập trung BoFU-1600 được thiết kế để xử lý các mẫu với kích thước lô lớn hơn với 16 vị trí mẫu và khả năng xử lý riêng lẻ hoặc theo lô.

Câu hỏi quan trọng về mua hàng là, "Hệ thống nào có nhiều vị thế nhất?"

Tức là, "có bao nhiêu mẫu thực sự được xử lý cùng nhau, và những mẫu đó cần các giao thức khác nhau bao nhiêu?"

Xem xét nhiều hơn kích thước mảnh trung bình

Một mẫu DNA thành công không tạo ra quy trình phân mảnh DNA thành công.

Một lần chạy kiểm tra không nên là lần chạy sạch nhất, mà phải lặp lại và lặp lại các đợt lặp trên phạm vi thời gian. Các nhà khoa học nên xem xét liệu phân bố mảnh có còn phù hợp không, có đuôi bất thường hay phân bố mảnh có trở nên rộng hơn, và liệu việc chuẩn bị thư viện phía sau có hoạt động nhất quán hay không.

Đây cũng là thời điểm mà phòng thí nghiệm nên quyết định cách kiểm tra chất lượng các mảnh thường xuyên.

QC chỉ được thực hiện trong quá trình phát triển phương pháp và không được sử dụng cho xử lý thường xuyên, những thay đổi nhỏ có thể tích tụ trước khi ai đó kịp phát hiện.

Mục đích không phải là chứng minh khả năng của máy siêu âm có thể phân mảnh DNA một lần.

Ý tưởng là tạo ra một quy trình có thể lặp lại.

Chọn nhạc cụ quanh bàn làm việc, không phải quanh tờ rơi.

Mỗi phòng thí nghiệm sẽ có giới hạn riêng.

Một nhóm nghiên cứu nhỏ làm vài mẫu DNA, RNA hoặc chromatin thỉnh thoảng có thể đánh giá cao quy trình làm việc tích hợp nhỏ. Một phòng thí nghiệm giải trình tự thực hiện nhiều mẫu đồng thời có thể quan tâm hơn đến xử lý song song. Có thể yêu cầu nhiều thông lượng hơn và các thiết lập lặp lại/truy vết giữa các nhà vận hành trong cơ sở lõi.

Vì lý do này, không thể chọn đúng hệ thống chỉ dựa trên công nghệ âm học.

Theo chính Longlight Câu hỏi thường gặp về máy siêu âm hội tụ, thay vì chỉ chọn thông số kỹ thuật, hãy xem xét các yếu tố như kiểm soát năng lượng âm thanh, tính nhất quán kích thước mảnh vỡ, thông lượng, khả năng tương thích với ống, bảo trì, ngân sách dịch vụ và ngân sách phòng thí nghiệm.

Kiểm tra xác thực cuối cùng

Trước khi tích hợp hệ thống phân mảnh DNA siêu âm vào quy trình chuẩn bị NGS thông thường của bạn, hãy đặt ra một số câu hỏi thực tiễn.

Có thể lấy được hồ sơ mảnh mong muốn trong phòng thí nghiệm với nhiều mẫu không? Có điều kiện đầu vào nào được chỉ định không? Nhiệt độ có được kiểm soát không? Định dạng ống/mẫu có phù hợp với quy trình không? Liệu có thể đạt được thông lượng cao hơn mà không cần thay đổi thủ công thừa thãi không?

Nếu câu trả lời cho những câu hỏi đó đã rõ ràng, thì bước siêu âm tạo ra một bộ gen phân mảnh giờ đây không còn là một bước siêu âm độc lập nữa, mà là về mục đích của nó: một sự chuyển giao có kiểm soát sang chuẩn bị thư viện.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1. Hệ thống phân mảnh DNA siêu âm là gì?

Nó cắt DNA một cách cơ học thành các mảnh nhỏ hơn, với năng lượng âm thanh được kiểm soát, để sử dụng trong các quy trình làm việc bao gồm chuẩn bị thư viện NGS. Năng lượng này có thể được truyền qua hệ thống tập trung qua môi trường âm thanh mà không cần chạm vào mẫu bằng đầu dò.

Câu hỏi 2. Liệu phân mảnh DNA NGS có thể thực hiện bằng siêu âm tập trung không?

Đúng vậy. Theo một danh sách được Longlight công bố, phân mảnh bộ gen cho NGS là một trong những ứng dụng của hệ thống siêu âm tập trung BoFU của Longlight. Vẫn còn một số điều kiện giao thức cần tối ưu cho mẫu và luồng cụ thể.

Câu hỏi 3. Liệu công suất siêu âm cao hơn có đồng nghĩa với việc tốt hơn không?

Không. Mục tiêu không nhất thiết là năng lượng âm thanh tối đa mà là phân bố các mảnh có thể tái tạo được để sử dụng cho các xử lý tiếp theo. Các thiết lập nên phụ thuộc vào điều kiện mẫu và giao thức.

Câu hỏi 4. Tại sao việc kiểm soát nhiệt độ trong quá trình cắt DNA lại quan trọng?

Bản chất của quá trình siêu âm là nhiệt sẽ được tạo ra, khiến nhiệt độ trở thành tham số xử lý. Điều kiện nhiệt kiểm soát rất quan trọng để duy trì các lần chạy tương đương khi lặp lại bằng cùng một phương pháp phân mảnh.

Câu hỏi 5. Tôi nên chọn hệ thống thông lượng nào trong các hệ thống khác nhau?

Hãy bắt đầu bằng việc xem xét số lượng mẫu thường được xử lý cùng lúc và liệu các mẫu đó có cần được xử lý trong cùng điều kiện hay khác nhau. BoFU-800 có thể xử lý từ 1–8 mẫu và BoFU-1600 có 16 vị trí mẫu cho quy trình làm việc lớn hơn.