Cắt Chromatin: Cách xây dựng quy trình làm việc ChIP có thể tái tạo

Cắt đứt chromatin là một trong những bước nhạy nhất trong giao thức ChIP. Các đoạn quá lớn có thể dẫn đến giảm độ phân giải và kết tủa miễn dịch kém. Cắt với cường độ quá cao có thể dẫn đến hư hại epitope, phức hợp DNA–protein và vật liệu có thể phục hồi.

Không có một chương trình duy nhất nào có thể áp dụng cho tất cả các mẫu. Phản ứng của chromatin với năng lượng siêu âm khác nhau tùy theo loại tế bào, cách cố định, vật liệu ban đầu và tùy thuộc vào hiệu suất phân giải chromatin cũng như thể tích mẫu. Toàn bộ quá trình chuẩn bị nên được kiểm soát để đạt được kết quả đáng tin cậy, thay vì chỉ thay đổi thời gian siêu âm.

Cái gì là Cắt của Chromatin?

Trước khi kết tủa miễn dịch, sự cắt đứt của chromatin sẽ phá vỡ chromatin liên kết chéo thành các đoạn DNA – protein nhỏ hơn. Kháng thể sau đó có thể được sử dụng để làm giàu chromatin liên quan đến một yếu tố phiên mã cụ thể, histone hoặc biến đổi histone.

Sau khi kết tủa miễn dịch, các liên kết chéo được đảo ngược, DNA được tinh khiết, và các vùng giàu được phân tích bằng qPCR hoặc giải trình tự. Longlight Giải pháp ChIP-seq hỗ trợ nghiên cứu tương tác protein–DNA và các vị trí điều hòa toàn bộ bộ gen.

Cắt chromatin khác với phân mảnh DNA tinh khiết vì nucleosome, protein liên quan và liên kết chéo formaldehyde làm thay đổi khả năng tiếp cận và tính chất cơ học của DNA.

Tại sao lại là Fragment Kích thước Quan trọng?

Các mảnh lớn sẽ làm giảm độ phân giải vị trí vì DNA thu hồi có thể dài hơn nhiều so với vị trí liên kết protein. Chúng cũng có thể tạo ra nền khi có các vùng xung quanh không đặc hiệu nhưng vẫn liên kết vật lý.

Đừng cho rằng các đoạn rất ngắn nhất thiết tốt hơn. Quá nhiều xử lý có thể dẫn đến mất sản lượng kết tủa miễn dịch, mất epitope nhạy cảm hoặc hồ sơ thư viện không phù hợp.

Kích thước mảnh tối ưu sẽ thay đổi dựa trên giao thức ChIP, mục tiêu sinh học, kháng thể sử dụng và phân tích tiếp theo. Do đó, các phòng thí nghiệm nên xác định phân bố chấp nhận được cho xét nghiệm của mình chứ không chỉ là kích thước trung bình phổ quát.

Còn về Cắt với liên kết chéo?

Liên kết chéo sẽ duy trì tương tác protein-DNA, trong khi liên kết chéo quá mạnh có thể khiến chromatin khó bị phân mảnh và che khuất các epitope kháng thể. Tương tác yếu hoặc thoáng qua có thể bị mất do không cố định đủ.

Thời gian cố định thay đổi tùy theo loại mẫu, nồng độ thuốc thử, mật độ tế bào và protein mục tiêu. Quá trình làm nguội cũng phải đồng nhất vì hành vi của mẫu sẽ thay đổi khi liên kết chéo tiếp theo.

Nếu mẫu vẫn chống lại sự cắt dù đã tăng lượng năng lượng âm thanh, thì điều này sẽ không giải quyết được vấn đề cơ bản. Cần xem xét các điều kiện liên kết chéo và dập tắt trước khi áp dụng một chương trình mạnh mẽ hơn.

Tại sao chọn đầu vào ô và Lysis có quan trọng không?

Dư thừa tế bào trong một lượng nhỏ có thể tạo ra chromatin đặc, dính và bị cắt không đều. Quá ít nguyên liệu ban đầu có thể làm tăng tổn thất khi xử lý và làm khó đánh giá chất lượng chromatin.

Số lượng tế bào giữa các thí nghiệm nên được cân bằng. Mẫu mô cần được chăm sóc đặc biệt vì có nguy cơ cao tạo ra ly ly dị thể do vật liệu ngoại bào, sự khác biệt cấu trúc và phân ly không hoàn toàn.

Trước khi siêu âm, việc giải phóng hiệu quả các nhân và nhiễm sắc thể là rất quan trọng. Phân hủy không hoàn chỉnh có thể dẫn đến sự hiện diện của nhân chưa bị phá vỡ hoặc các cụm tế bào tiếp xúc với năng lượng theo cách khác với phần còn lại của mẫu.

Tập trung thế nào siêu âm Giúp cải thiện khả năng kiểm soát?

Máy siêu âm đầu dò được sử dụng khi năng lượng được truyền trực tiếp đến mẫu. Sự biến động và tiềm năng ô nhiễm có thể xuất phát từ vị trí đầu dò, độ sâu ngâm và kỹ thuật của người vận hành.

Siêu âm tập trung được sử dụng để dẫn năng lượng âm thanh qua môi trường kết nối vào một bình mẫu kín. Điều này tạo ra môi trường xử lý không tiếp xúc được kiểm soát tốt hơn.

Các Máy siêu âm hội tụ BoFU-100 cung cấp khả năng cắt DNA, RNA và chromatin được kiểm soát nhiệt độ. The Hệ thống BoFU-1600 cung cấp tùy chọn quy trình phòng thí nghiệm đa kênh khi xử lý nhiều mẫu.

Những tham số nào cần được tối ưu hóa?

Cường độ âm học, chu kỳ làm việc, thời gian xử lý, số chu kỳ, thời gian tạm dừng, thể tích mẫu và nhiệt độ mẫu là những biến số quan trọng.

Thay đổi từng biến chính một trong quá trình tối ưu ban đầu. Khi cường độ, thời gian và/hoặc nồng độ tế bào được thay đổi đồng thời, rất khó xác định kết quả tốt hơn hay xấu hơn do một trong hai thay đổi.

Kiểm tra một ma trận nhỏ các điều kiện quanh một điểm khởi đầu hợp lý và so sánh phân bố mảnh vỡ cũng như khả năng phục hồi DNA

- KHÔNG phải phương pháp điều trị mạnh nhất dẫn đến DNA ngắn nhất!

Sau khi chọn chương trình, lưu chương trình với đầu vào đo tế bào, bộ đệm, ống và thể tích mẫu. Nếu không có các điều kiện đi kèm này, các thông số siêu âm không thể tái tạo một cách đáng tin cậy.

Tại sao lại như vậy Quan trọng rằng các mẫu phải được giữ mát?

Phương pháp điều trị siêu âm đi kèm với hiệu ứng nhiệt và chromatin có thể nhạy cảm với nhiệt. Tổn thương protein, mất nhận diện kháng thể và tăng biến thiên có thể là yếu tố gây nhiệt.

Quá trình làm mát trong suốt quá trình chạy nên giống nhau (ngay cả trong thời gian nghỉ giữa các lần chạy). Tốc độ di chuyển của các ống giữa xô đá và thiết bị không nên ảnh hưởng đến nhiệt độ mẫu.

Cắt Chất lượng Kiểm tra: Như thế nào?

Sau khi cắt, lấy một phân tích đại diện. Đảo ngược các liên kết chéo, làm sạch DNA và đánh giá toàn bộ phân bố kích thước mảnh bằng điện di gel agarose hoặc máy phân tích mảnh tự động phù hợp.

Đừng đánh giá chromatin liên kết chéo chưa được xử lý như thể đó là DNA tinh khiết. Kích thước biểu kiến có thể gây hiểu lầm do sự thay đổi di chuyển do protein và liên kết chéo gây ra.

Phần lớn vật liệu nên nằm trong giới hạn của phạm vi "chấp nhận" của phòng thí nghiệm với rất ít hoặc không có quần thể lớn vật liệu có trọng lượng phân tử cao. Lượng DNA thu hồi cũng nên được đo lường vì một hồ sơ tốt không có giá trị nếu phần lớn DNA đã bị mất.

Tại sao lại có Không nhất quán Céo cắt chromatin?

Những nguyên nhân này là do sự cố định thay đổi, số lượng tế bào không chính xác, quá trình ly giải không hoàn chỉnh, thể tích mẫu thay đổi, loại ống khác nhau và sự lệch nhiệt độ.

Bọt hoặc bong bóng khí là một vấn đề có thể ảnh hưởng đến liên kết âm học. Do đó, các ống mẫu phải được đầy, đậy nắp và đặt theo cùng một cách. Để phát triển phương pháp, ống từ loại đã được xác nhận hoặc lô hàng được xác nhận được ưu tiên.

Nếu có sự khác biệt giữa các kết quả từ một lô, điều này có thể cho thấy có ảnh hưởng đến vị trí mẫu hoặc thời gian chuẩn bị mẫu có thể không nhất quán. Một nhật ký chạy đơn giản có thể hữu ích để xem có sự khác biệt nào liên quan đến sinh học, quy trình hoặc dụng cụ hay không.

Làm thế nào để tối ưu hóa một loại mẫu mới?

Bắt đầu với vật liệu cố định nhỏ và ma trận âm học với vật liệu đại diện cho thí nghiệm thực tế. Đừng sử dụng mẫu vật có giá trị hoặc không thể thay thế cho bài kiểm tra ban đầu.

Đánh giá phân bố mảnh vỡ, khả năng thu hồi DNA và hiệu quả kết tủa miễn dịch. Sau khi cắt, khả năng thích hợp của nhiễm sắc thể đối với ChIP có thể được đánh giá bằng kháng thể kiểm soát dương và vị trí mục tiêu đã biết.

Khi đã tối ưu, thiết lập các tham số quan trọng trong SOP. Để biết thêm thông tin về siêu âm hội tụ để chuẩn bị chromatin, vui lòng xem Longlight Trang ứng dụng ChIP.

Kết thúc

Không chỉ liên quan đến công suất siêu âm để tạo ra sự cắt sắc chromatin đáng tin cậy. Các thành phần khác nhau như cố định, đầu vào tế bào, phân hủy tế bào, hình học mẫu, cũng như điều kiện âm học và nhiệt độ đều phải tương thích với nhau.

Phương pháp tối ưu sẽ cho ra phân bố mảnh phù hợp và duy trì hiệu suất kết tủa miễn dịch cũng như thu hồi vật liệu. Mỗi phòng thí nghiệm đều được chào đón liên hệ với Longlight qua trang liên hệ để cung cấp thông tin về loại và lô mẫu cũng như quy trình làm việc ChIP mà họ muốn sử dụng, nhằm hỗ trợ thiết bị và ứng dụng.

Câu hỏi thường gặp

Q1. Tại sao lại cần phải cắt đứt chromatin?

Nó phá vỡ chromatin liên kết chéo thành các mảnh nhỏ hơn để lấy IP. Việc sử dụng các đoạn có kích thước kiểm soát sẽ tăng độ phân giải của ChIP-qPCR và ChIP-seq.

Q2. Điều gì sẽ xảy ra nếu chromatin bị cắt dưới mức độ cắt?

Các mảnh rất lớn có thể gây mất độ phân giải và làm tăng nền không đặc hiệu. Hãy cân nhắc đánh giá lại các điều kiện cố định, phân giải và âm học trước khi tự động kéo dài quá trình xử lý.

Q3. Có thể cắt chromatin quá mức không?

Có. Nếu sử dụng quá nhiều phương pháp điều trị, quá trình phục hồi sẽ bị suy giảm hoặc các epitope protein và phức hợp DNA–protein sẽ bị tổn thương. Không phải lúc nào cũng nên sử dụng các đoạn ngắn hơn.

Q4. Chromatin có cần được giữ lạnh trong quá trình siêu âm không?

Có. Quá trình xử lý ở nhiệt độ thấp ổn định, giúp giảm thiệt hại cho mẫu và protein do nhiệt. Nhiệt độ nên ổn định giữa các mẫu và lô sản phẩm.

Q5. Có một chromatin-she duy nhất khôngmộtChương trình vòng có thể áp dụng cho tất cả các loại tế bào?

Thông thường thì không. Sự khác biệt giữa cấu trúc tế bào, mật độ chromatin, phản ứng cố định và nồng độ mẫu tồn tại và các loại mẫu mới nên được tối ưu hóa hạn chế.