Điện di gel ngang cho DNA plasmid: Tách các dạng siêu cuộn, vết nứt và tuyến tính

Điện di DNA là một phương pháp được sử dụng rộng rãi trong sinh học phân tử. Một trong những ứng dụng yêu cầu mức độ phân tách cao nhất là xác định ba dạng tô pô chính của DNA plasmid, đó là các dạng siêu cuộn, vết nứt (hình tròn mở) và tuyến tính. Chúng tôi sẽ chỉ ra cách Hệ thống gel ngang HE-50 mới cung cấp khả năng cách ly plasmid và kiểm soát chất lượng cho phép tách và tái tạo tốt hơn.

[Năm cân nhắc cho quá trình điện di gel axit nucleic | Thermo Fisher Scientific - Hoa Kỳ]

Cấu trúc liên kết Plasmid: Ba dạng

DNA plasmid không đồng nhất và là hỗn hợp của ba đồng dạng tô pô. Trong bối cảnh cô lập, các dạng này sẽ mang lại tốc độ di chuyển khác nhau trong quá trình điện di DNA.

• Dạng siêu cuộn (SC): Plasmid siêu cuộn được coi là loài di cư nhanh nhất trong gel agarose.

• Dạng Nicked (hình tròn mở / OC): Sự sắp xếp tròn của DNA plasmid có một đứt sợi đơn bây giờ được thư giãn và do đó bị nứt. Do kích thước hiệu quả lớn hơn, đồng dạng này di chuyển chậm hơn so với DNA siêu cuộn.

• Dạng tuyến tính: Sự đứt gãy của cả hai sợi cộng hóa trị của plasmid dẫn đến DNA tuyến tính. Dạng DNA plasmid này có cấu trúc hình que và sự di chuyển của nó chậm hơn so với siêu cuộn, nhưng nhanh hơn vết nứt.

Khi phân tích chất lượng của DNA plasmid được sử dụng để sản xuất vắc-xin plasmid DNA, các cơ quan quản lý hàng đầu yêu cầu chế phẩm bao gồm ít nhất 80% plasmid ở dạng siêu cuộn.

Tầm quan trọng của cấu trúc liên kết Plasmid trong nghiên cứu và dược phẩm sinh học

Trong DNA plasmid, dạng đồng dạng ảnh hưởng đến một số yếu tố trong các quá trình liên quan đến vắc-xin:

• Truyền sang tế bào động vật có vú: Dạng siêu cuộn của DNA plasmid là hiệu quả nhất trong việc truyền tế bào động vật có vú so với các dạng thư giãn và tuyến tính.

• Sản xuất vắc-xin mRNA: Nhu cầu về các mẫu plasmid tuyến tính để phiên mã in vitro (IVT) gây ra các chất gây ô nhiễm plasmid tròn mở, ảnh hưởng đến năng suất và tính nhất quán.

• Sản xuất vectơ liệu pháp gen: Plasmid siêu cuộn chất lượng cao rất cần thiết cho việc sản xuất vectơ liên quan đến adeno (AAV).

• Giám sát độ ổn định: Điều kiện bảo quản và thời gian bảo quản ảnh hưởng đến độ ổn định của plasmid khi tần suất của các dạng vết nứt hoặc tuyến tính tăng lên.

Những tiến bộ nghiên cứu gần đây trong phân tích DNA plasmid

Hai trong số các nghiên cứu gần đây nhấn mạnh tầm quan trọng của việc phân tách DNA plasmid có độ phân giải cao:

1. Vết nứt plasmid qua trung gian ZorE (2025)

Một nghiên cứu được công bố trên Nature Communications (tháng 3 năm 2025) nhằm vào các hệ thống bảo vệ vi khuẩn và chứng minh khả năng kiểm soát các cấu trúc liên kết plasmid. Nhóm nghiên cứu thuộc Viện Zorya đã mô tả sự biến đổi chậm của DNA plasmid pSG483 siêu cuộn thành các dạng tuyến tính và vết nứt của nó bởi protein ZorE. Đây được ghi nhận là một quá trình dần dần và sự biến đổi đã được phân tích định lượng bằng cách sử dụng ImageJ để thực hiện nghiên cứu đo mật độ. Người ta lưu ý rằng các plasmid siêu cuộn dần dần bị ZorE (768 nM) cắt sau 60 phút ủ ở 37 °C.

[Vết cắt plasmid qua trung gian ZorE (2025)]

*"Phản ứng đã được dừng lại bằng cách thêm EDTA và SDS, và các sản phẩm được tách ra bằng cách sử dụng điện di gel trong dung dịch đệm 1× TAE, gel agarose 1,4% và được nhuộm sau bằng eb."* - Truyền thông Thiên nhiên, 2025

Khám phá này được phát hiện là rất quan trọng đối với các nghiên cứu tương tác đoạn DNA và protein được thực hiện bằng cách sử dụng hệ thống gel.

2. Protein sửa chữa DNA và DNA không phải B (2025)

Một ấn phẩm PNAS từ NIH vào tháng 1 năm 2025, đã chứng minh rằng việc chèn các lần lặp lại dinucleotide vào plasmid pUC18 có tác dụng cis đối với sự liên kết của các protein sửa chữa không phù hợp Mlh1-Pms1. EMSA đã thử nghiệm liên kết protein ở nồng độ từ 25 nM đến 400 nM trong cả DNA siêu cuộn và tuyến tính. DNA dạng không phải B làm gián đoạn các chức năng sửa chữa protein và bổ sung thêm sự hiểu biết về sự không ổn định của DNA.

[DNA không phải B và protein sửa chữa DNA (2025)]

Những cân nhắc quan trọng trong quá trình điện di DNA plasmid

Trong quá trình điện di DNA plasmid, việc tối ưu hóa độ phân giải điện di là rất quan trọng.

Hệ thống gel ngang HE-50: Hệ thống được lựa chọn

Thuộc tính Hệ thống gel ngang HE-50 từ Công nghệ Longlight, sử dụng một thiết kế đồng nhất có lợi cho quá trình điện di DNA plasmid.

1. Tách chất lượng cao

• Điện cực bạch kim nguyên chất 99,95%: một yếu tố thiết kế quan trọng để giải quyết siêu cuộn từ các đồng dạng bị nứt.

• Định dạng gel linh hoạt: Các nhà nghiên cứu có thể chọn kích thước gel với bất kỳ kích thước khay nào trong số bốn kích thước khay có sẵn: 60×60 mm, 60×120 mm, 120×60 mm và 120×120 mm. Kích thước lớn nhất cung cấp khoảng cách di chuyển đủ dài để hình dung các đồng dạng di chuyển chặt chẽ với độ phân giải cao hơn.

2. Thiết kế hướng đến người dùng

• Khay nạp có hướng dẫn với nền đen: Thước huỳnh quang với nền tối cho phép căn chỉnh cẩn thận đầu pipet với giếng khi nạp nhiều mẫu để so sánh trực tiếp.

• Bể Polycarbonate có độ trong suốt cao: Thiết kế khả năng hiển thị cao với bể tích hợp cho thấy sự di chuyển của mặt trước thuốc nhuộm và quá trình điện di mà không cần mở bể và làm gián đoạn hệ thống.

3. An toàn và hiệu quả

• Nắp tự động tắt: Công tắc an toàn cắt điện khi mở nắp để loại bỏ nguy cơ điện giật trong khi người dùng nạp mẫu hoặc loại bỏ gelatin.

• Tiêu thụ bộ đệm thấp: Buồng di chuyển phía dưới kết hợp thiết kế cầu sử dụng ít đệm hơn trong khi cung cấp đủ môi trường ion để thực hiện điện di DNA nhất quán và đáng tin cậy.

Các bước phân tích đồng dạng plasmid

Để có được sự tách DNA plasmid tối ưu bằng hệ thống HE-50:

• Làm Gel Agarose: Chọn bất kỳ kích thước khay nào trong số bốn kích thước khay để đúc gel agarose 0.8-1.0%. Phân tích các plasmid có kích thước từ 3 - 10 kb với 1× TAE đệm agarose gel.

• Chuẩn bị mẫu: Kết hợp các mẫu DNA plasmid với thuốc nhuộm tải. Sử dụng 200 - 500 ng DNA plasmid. Tỷ lệ của mẫu thuốc nhuộm: thuốc nhuộm nạp có thể là 1: 6, 1: 3 hoặc 1: 1,5. Sử dụng pipet, nạp thuốc nhuộm plasmid samples vào giếng agarose.

• Điện di: Gel có kích thước 120 x 120 mm nên chạy ở 100 V. Đối với gel 100 x 100 mm, sử dụng 80V. Màu xanh bromophenol được phép chạy trong 45-60 phút. Quá trình điện di dừng lại khi thuốc nhuộm đạt đến 2/3 đường xuống đáy.

• Trực quan hóa và tài liệu: Nắp trong suốt, lộ ra ngoài cho phép gel được UV và chụp ảnh trong khi nắp vẫn còn nguyên vị trí. Khi có thước phân tử, huỳnh quang dương được quan sát thấy.

• Định lượng phân phối Isoform: Hệ thống tài liệu gel tự động định lượng cường độ dải. Tỷ lệ phần trăm DNA siêu cuộn được xác định bởi những điều sau: [Cường độ SC] / (Cường độ tuyến tính SC OC) × 100.

Tích hợp quy trình làm việc không bị cản trở

Hệ thống HE-50 được thiết kế để tích hợp không bị cản trở vào quy trình làm việc của phòng thí nghiệm hiện có:

• Tích hợp nguồn điện: Phích cắm chuối 4 mm cần thiết tương thích với hầu hết các nguồn điện điện di (chúng tôi khuyên bạn nên sử dụng điện áp không đổi).

• Tích hợp hệ thống hình ảnh: Nắp trong suốt tia cực tím tương thích với các hệ thống hình ảnh tài liệu gel tiêu chuẩn, loại bỏ nhu cầu chuyển gel từ bể chứa sang máy chụp ảnh.

• Áp dụng giao thức: Hệ thống tương thích với tất cả các nồng độ gel agarose tiêu chuẩn và dung dịch đệm điện di (TAE, TBE, SB), cho phép áp dụng các giao thức phân tích plasmid đã công bố trước đó.

Kết thúc

Điện di DNA là phương pháp đơn giản và phổ biến nhất để đánh giá chất lượng của DNA plasmid. Các nhà nghiên cứu có thể sử dụng kiến thức của họ về sự di chuyển của các đồng dạng siêu cuộn, vết nứt và tuyến tính để tối ưu hóa việc tách và giải thích kết quả. Hệ thống gel ngang HE-50 cung cấp các khả năng - điện cực bạch kim nguyên chất, kích thước gel có thể lựa chọn, hướng dẫn tải và điều khiển - cần thiết cho phân tích plasmid thông thường. Như đã nêu trong Nature Communications (2025) và NIH (2025), điện di gel agarose là một trong những phương pháp cơ bản để phân tích tương tác giữa DNA và protein cũng như cấu trúc liên kết hoặc cấu trúc của DNA.

Hệ thống gel ngang HE-50 có tiềm năng được tích hợp đầy đủ và mô-đun cho các hệ thống hình ảnh; bằng cách này, nó cung cấp cho khách hàng nhiều lựa chọn hơn cho các hệ thống hình ảnh DNA plasmid giá cả phải chăng. Để tìm hiểu thêm, vui lòng gửi yêu cầu báo giá đến Longlight Technology.

Câu hỏi thường gặp

Quý 1. Điện di gel ngang có thể xác định DNA plasmid siêu cuộn và có vết nứt không?

Hệ thống HE-50 có thể xác định các plasmid DNA siêu cuộn, vết nứt và tuyến tính miễn là đạt được tính đồng nhất của điện trường và sử dụng gel agarose 0,8-1,2%.

Quý 2. Tốc độ di chuyển khác nhau của các dạng plasmid khác nhau trong quá trình điện di là gì?

Bởi vì các dạng plasmid có cấu trúc khác nhau, chúng thể hiện tốc độ di chuyển khác nhau khi chịu quá trình điện di. Ví dụ, các dạng plasmid tuyến tính di chuyển nhanh hơn các dạng tròn. DNA ở dạng tuyến tính có tốc độ di chuyển vừa phải, trong khi DNA ở dạng tròn có vết nứt hoặc hình tròn mở có tốc độ di chuyển chậm nhất.

Câu 3. Bao nhiêu phần trăm DNA siêu cuộn được coi là chất lượng cao để truyền thai?

Một dạng siêu cuộn của DNA plasmid lớn hơn 80% thường được coi là một chế phẩm plasmid chất lượng cao để truyền nhiễm và liệu pháp gen.

Câu 4. Tôi có thể sử dụng dung dịch đệm TAE thay vì TBE để tách các đồng dạng plasmid không?

Có, trong hầu hết các trường hợp, dung dịch đệm TAE có thể được sử dụng để phân tích plasmid. Tuy nhiên, dung dịch đệm TBE là tối ưu để tách các đồng dạng plasmid khi sự khác biệt là tối thiểu và trong các lần tách mở rộng.

Câu 5. Tại sao các mẫu plasmid của tôi hiển thị nhiều dải trên gel?

Nhiều dải thường được quan sát thấy đối với các dạng siêu cuộn, vết nứt và tuyến tính của plasmid. Các dải khác có thể là kết quả của tiêu hóa kém hoặc nhiễm DNA và RNA bị phân hủy.