Hướng dẫn tối ưu hóa phân mảnh DNA trong các mẫu khó ly giải

Phân mảnh DNA là một bước không thể thiếu trong việc chuẩn bị mẫu trên nhiều lĩnh vực khác nhau bao gồm bộ gen, chẩn đoán phân tử và proteomics. Tuy nhiên, sự hiện diện của thành tế bào mạnh hoặc mô cứng đặt ra một thách thức lớn trong việc đạt được sự phân mảnh DNA nhất quán, chất lượng cao. Hướng dẫn này giải quyết những khó khăn liên quan đến các sinh vật và mô cứng đầu để ly giải, cung cấp một số khuyến nghị tối ưu hóa dựa trên bằng chứng và thảo luận về những ưu điểm của công nghệ siêu âm hội tụ.

[Phân mảnh DNA | Nhiệm vụ sinh học AAT]

Những thách thức liên quan đến các mẫu cứng đầu để ly giải

Phạm vi các mẫu sinh học được tìm thấy trong các phòng thí nghiệm nghiên cứu và lâm sàng trải dài các vương quốc vi sinh vật và thực vật. Thành tế bào mạnh mẽ của các sinh vật như mycobacteria và các chủng hình thành bào tử, cũng như các mô thực vật giàu cellulose và lignin, chống lại hầu hết các phương pháp chuẩn bị mẫu tiêu chuẩn.

Điều gì khiến một số mẫu miễn cưỡng ly giải?

• So với tế bào động vật, màng tế bào của vi khuẩn Gram dương, mycobacteria, nấm và thực vật cần nhiều năng lượng hơn, cơ học hoặc hóa học, để bị phá vỡ.

Ảnh hưởng của việc ly giải không đủ là gì?

• Sự gián đoạn mẫu kém dẫn đến năng suất DNA thấp, thư viện giải trình tự sai lệch và tác động hạ nguồn của PCR như hiệu quả thấp và định lượng kém.

Đối với các loại mẫu như vậy, các phương pháp tiêu chuẩn như phân hủy hóa học, chu trình đông lạnh-rã đông và đánh hạt dựa vào việc thực hiện sự gián đoạn cơ học có kiểm soát tốt hơn do kết quả không nhất quán của chúng.

Những tiến bộ trong hiểu biết về phân mảnh DNA

Những khám phá khoa học quan trọng đã xây dựng nền tảng để hiểu về sự phân mảnh. Trong một nghiên cứu lớn vào năm 2025, Fu và cộng sự đã phát minh ra một phương pháp cắt siêu âm qua trung gian bởi các hạt zirconia, chỉ với 20 giây siêu âm, có thể tạo ra kích thước mảnh khoảng 15 cặp kilobase từ λDNA tinh khiết. Phương pháp này đã vượt qua ranh giới của giải trình tự đơn phân tử (SMS) bằng cách cung cấp một giải pháp cho nút thắt cổ chai của việc sản xuất các mảnh ≥10 kbp không hiệu quả bằng cách sử dụng các kỹ thuật cắt siêu âm truyền thống để chuẩn bị thư viện SMS.

[Một chiến lược siêu âm qua trung gian hạt zirconia nhanh chóng và hiệu quả cho

Phân mảnh DNA lên đến 10 kbp - RSC Advances]

Trong một công trình lớn khác được công bố vào năm 2025, Hahmann và các đồng nghiệp từ Viện Nghiên cứu Polymer Max Planck và Đại học RWTH Aachen đã mô tả việc sử dụng siêu âm để đạt được sự phân mảnh DNA có kiểm soát trình tự. Công trình này mô tả sự chuyển hướng của sự phân mảnh ngẫu nhiên trước đây đến các điểm yếu cụ thể và có chủ ý của một chuỗi DNA bị cắt một phần bằng cách sử dụng các nick. Được công bố trên tạp chí Chem, công trình này đã đưa ra những ý tưởng mới và các khía cạnh bổ sung cho việc phát triển các giao thức để đạt được sự phân mảnh có kiểm soát của các mẫu phức tạp và đầy thách thức.

Những thách thức và cân nhắc trong quá trình phân mảnh DNA

[Johannes Hahmann, Boris N. Schüpp, Aman Ishaqat, Arjuna Selvakumar,

Robert Göstl, Frauke Gräter và Andreas Herrmann.

"Cơ hóa DNA theo trình tự cụ thể, không có cơ học." Hóa học (2025).]

Để đạt được sự phân mảnh DNA trong các mẫu kháng thuốc, một số thông số phải được kiểm soát và tinh chỉnh. Kết quả có thể được cải thiện bằng cách điều chỉnh những điều sau:

• Cường độ và biên độ siêu âm: Cường độ cao hơn mang lại nhiều xâm thực hơn và gián đoạn tốt hơn. Cường độ cao hơn cũng làm tăng nguy cơ hư hỏng nhiệt và cơ học cho mẫu.

• Thời gian xử lý: Sonication trong thời gian dài có thể dẫn đến sự phân mảnh quá mức không thể chấp nhận được.

• Thể tích và nồng độ mẫu: Năng lượng đầu vào cho các mẫu pha loãng và cô đặc khác nhau. Sự khác biệt này cần được đo lường để xác định thể tích mẫu tối ưu.

• Thành phần đệm: Việc sử dụng chất tẩy rửa và chất chelator gây ra sự suy yếu hiệp đồng của thành tế bào và được tăng cường bởi sự gián đoạn cơ học, do đó cải thiện năng suất.

• Kiểm soát nhiệt độ: Việc mất độ ổn định nhiệt có thể khiến các mẫu bị phân mảnh bị biến tính và mất tính toàn vẹn của cấu trúc. Điều này có thể xảy ra nếu hệ thống ở trong điều kiện đẳng nhiệt.

• Số lượng hạt và kích thước của chúng: Trong phân mảnh hạt, kích thước và số lượng hạt rất quan trọng.

Saputra et al. (2024) đã so sánh một số phương pháp chiết xuất DNA. Họ cho thấy rằng siêu âm dẫn đến DNA chất lượng cao. Theo dữ liệu của họ, 61% DNA siêu âm có độ hấp thụ từ 1,8 đến 2,0, với nền bước sóng thấp hơn ít rõ rệt hơn. Ngược lại, chiết xuất DNA bằng phương pháp cột quay dẫn đến năng suất DNA chiết xuất cao hơn. Điều này cho thấy rằng trong một số phương pháp chẩn đoán, độ tinh khiết của mẫu có thể quan trọng hơn nồng độ mẫu.

Công nghệ siêu âm hội tụ: Một giải pháp thay thế chính xác

Các kỹ thuật phổ biến của các phương pháp dựa trên siêu âm có một số nhược điểm. Máy siêu âm đầu dò gây ô nhiễm mẫu và cần làm sạch chuyên sâu, và cuối cùng là nguyên nhân làm nóng mẫu không kiểm soát. Máy siêu âm bồn tắm nước phân tán năng lượng và mang lại kết quả không nhất quán.

Nền tảng siêu âm tập trung, như BoFU-800 ·, sử dụng một thiết kế hoàn toàn khác. Loại bỏ tổn thất năng lượng và mang lại kết quả có độ lặp lại cao và độ tin cậy khi xử lý các mẫu khó chỉ là một vài trong số những lợi thế bổ sung của quá trình siêu âm.

• Xử lý không tiếp xúc: Hệ thống năng lượng tập trung siêu âm trong môi trường âm thanh đến mẫu. Tiếp xúc mẫu/đầu dò được loại bỏ và không có khả năng nhiễm bẩn mẫu.

• Kiểm soát nhiệt độ thấp thực sự: Nhiệt của quá trình xử lý siêu âm không ảnh hưởng đến kết quả. Với việc đo lường và kiểm soát nhiệt độ được cải thiện, chúng tôi có thể thực hiện các thay đổi chính xác và có chủ ý đối với nhiệt độ trong mẫu.

• Thông lượng thích ứng: Mỗi vị trí trong số tám vị trí mẫu có thể có cài đặt người dùng tùy chỉnh, riêng lẻ. Người dùng cũng có thể xử lý từ một đến tám mẫu. Hệ thống cho phép thông lượng linh hoạt.

• Chế độ xử lý hàng loạt: Khi mẫu ở mỗi vị trí giống nhau, cài đặt tùy chỉnh có thể được áp dụng cho tất cả các vị trí mẫu. Điều này cho phép người dùng xử lý một số vị trí mẫu bằng một lệnh.

• Truy xuất nguồn gốc đầy đủ: Thông tin liên quan đến quá trình xử lý từng mẫu có thể được truy cập bất cứ lúc nào, cho phép truy xuất nguồn gốc đầy đủ của hồ sơ thí nghiệm.

Ứng dụng cho các loại mẫu cụ thể

Mycobacteria

Thành tế bào của Mycobacterium tuberculosis rất giàu axit mycolic và cực kỳ khó xâm nhập. Siêu âm hội tụ tạo ra xâm thực cơ học và phá vỡ thành tế bào để hoàn thành bước ly giải lõi trong khoảng 60 giây. Tổng thời gian để hoàn thành quá trình từ nuôi cấy khuẩn lạc đến chiết xuất mẫu là dưới năm phút.

Nấm dạng sợi

Thành tế bào của nấm dạng sợi có chứa chitin và glucan. Mặc dù chúng có thể khó thâm nhập, nhưng siêu âm hội tụ có thể giảm thời gian chuẩn bị mẫu xuống dưới năm phút và chỉ cần 60 giây siêu âm.

Nguyên liệu thực vật

Các thành phần chính của thành tế bào thực vật là lignin và cellulose. Đối với siêu âm hội tụ, khả năng đồng nhất và phân mảnh đồng đều và nhất quán của nó rất quan trọng để đáp ứng các nhu cầu đa dạng từ chiết xuất DNA mô thực vật và động vật.

Mẫu FFPE

Đối với các mô FFPE, liên kết chéo formaldehyde đưa ra những thách thức ở mọi giai đoạn của quá trình. Siêu âm hội tụ hợp lý hóa việc chuẩn bị mẫu bằng cách kết hợp khử parafin, ly giải và phân mảnh DNA thành một bước nhanh chóng và hiệu quả, tối đa hóa năng suất mẫu.

Ví dụ về giao thức tối ưu

Khi làm việc với một loại mẫu mới khó ly giải, chiến lược phát triển phác đồ hiệu quả nhất như sau:

• Sử dụng cài đặt của nhà sản xuất làm cơ sở: Thông thường, các giao thức cụ thể của loại mẫu được hiệu chuẩn trước và có thể dựa vào.

• Xác định kích thước mảnh được chấp nhận: Đối với NGS, kích thước mảnh xây dựng thư viện thường nằm trong khoảng từ 300 đến 500 bp, trong khi trình tự đọc dài ≥ 10 kbp. Cân nhắc kích thước phù hợp.

• Thời gian cắt công suất không đổi trong thí nghiệm thời gian: Tối ưu hóa độ dài của cửa sổ thời gian.

• Xác nhận điện di: Trong các nghiên cứu thời gian, hãy xem xét việc chuẩn bị mẫu và kích thước mảnh.

• Ghi lại và truyền đạt tất cả các thông số cần thiết: để một bước chuẩn bị mẫu được sao chép chính xác, nó phải được ghi lại đầy đủ trong các giao thức liên quan.

• Kiểm soát nhiệt: Nhiệt độ mẫu phải nằm trong phạm vi nhiệt độ mục tiêu để tránh sự xâm nhập của các hiện vật nhiệt.

Hướng đi trong tương lai

Sau một số nghiên cứu được trích dẫn trước đó từ năm 2025, chúng ta sẽ tiếp tục thấy sự tích hợp của chẩn đoán và kỹ thuật lâm sàng với sinh học phân tử dẫn đến việc tạo ra các công cụ tiên tiến và mạnh mẽ hơn để phân mảnh DNA.

Lei và cộng sự đã chỉ ra cách các thiết bị siêu âm hội tụ cường độ cao thu nhỏ, với khả năng phù hợp với sự phân mảnh mẫu của các thiết bị thương mại, có thể giải quyết các vấn đề lây nhiễm chéo và xử lý không nhất quán với các hệ thống truyền thống. Đây là một bước hướng tới chiết xuất axit nucleic tích hợp và tự động hơn, đồng thời việc chuẩn bị mẫu trong phòng thí nghiệm sẽ trở nên tiêu chuẩn hóa và sẵn có hơn.

Đối với các phòng thí nghiệm nghiên cứu và chẩn đoán kết hợp công nghệ siêu âm hội tụ để tối ưu hóa sự phân mảnh cho các mẫu khó phân giải, lợi ích của công nghệ siêu âm hội tụ, bao gồm độ chính xác, dễ thực hiện và khả năng tái tạo, rất hấp dẫn. Sự kết hợp của quy trình làm việc đã được xác nhận cho nhiều loại mẫu, chẳng hạn như vi khuẩn mycobacteria, nấm sợi, mô thực vật và phần FFPE, trên một thiết bị duy nhất, cải thiện hiệu quả phòng thí nghiệm và chất lượng dữ liệu được tạo ra, đồng thời tăng cường và đẩy nhanh quá trình dịch thuật nghiên cứu khoa học và thực hành lâm sàng.

Câu hỏi thường gặp

Quý 1. Phân mảnh DNA là gì? Nó có vai trò gì đối với các mẫu vật khó ly giải?

A. Phân mảnh DNA là cần thiết để chuẩn bị thư viện NGS. Bản thân sự phân mảnh đang phá vỡ DNA thành các mảnh nhỏ hơn. Giải trình tự thế hệ tiếp theo sử dụng phân tích DNA với các mẫu vật khó ly giải khác nhau, chẳng hạn như thực vật và vi khuẩn, chống lại quá trình ly giải thông thường.

Quý 2. Siêu âm hội tụ có thể xuyên qua mycobacteria mà không cần bất kỳ tiền xử lý hóa học nào không?

A. Siêu âm hội tụ cung cấp đủ năng lượng và căng thẳng cho lớp nấm của mycobacteria, và do đó có thể làm giảm điều trị hóa học hoặc loại bỏ hoàn toàn.

Câu 3. Siêu âm hội tụ khác với đánh hạt cho mô thực vật như thế nào?

A. Siêu âm hội tụ là không tiếp xúc và đẳng nhiệt, cung cấp một phương pháp xử lý cơ học đồng đều và cắt hơn, tạo điều kiện kiểm soát và giảm sự xuống cấp mô tốt hơn khi so sánh với đập hạt.

Câu 4. Kích thước điển hình của các đoạn DNA khi sử dụng siêu âm hội tụ là bao nhiêu?

A. Kích thước mảnh có thể thay đổi lớn hơn 10 kb và siêu âm có thể được sử dụng để nhắm mục tiêu các mảnh có 300-500 bazơ, trong khi kích thước điển hình cho giải trình tự thế hệ tiếp theo là khoảng 300-500 bazơ.

Câu 5. Siêu âm hội tụ có tác dụng phân mảnh DNA từ FFPE không?

Trả lời: Siêu âm hội tụ có thể đạt được hiệu quả quá trình khử parafin FFPE và ly giải tế bào trong khi cắt DNA liên kết ngang. Quá trình tập trung siêu âm diễn ra nhanh chóng và làm tăng năng suất tổng thể của DNA bị phân mảnh.