Bộ dụng cụ huỳnh quang: Hướng dẫn thực tiễn về định lượng mẫu nhạy

Trong các phòng thí nghiệm sinh học phân tử, DNA, RNA hoặc protein có thể được đo bằng bộ huỳnh quang kế sử dụng ánh sáng huỳnh quang. Các xét nghiệm này dựa trên các thuốc nhuộm có tín hiệu cao hơn khi gắn với một mục tiêu cụ thể, thay vì đo tổng hấp thụ tia UV. Tính chọn lọc này có lợi nếu mẫu bị pha loãng, thể tích nhỏ hoặc bị nhiễm các chất khác có thể gây nhiễu cho phép đo hấp thụ.

Một quy trình làm việc đầy đủ thường bao gồm một hóa chất thử nghiệm, bộ đệm pha loãng, tiêu chuẩn, ống thử nghiệm hoặc tấm thử nghiệm, và một máy đo huỳnh quang phù hợp với quy trình. Phạm vi xét nghiệm rất quan trọng để đạt được kết quả đáng tin cậy, cũng như tính nhất quán trong việc chuẩn bị tiêu chuẩn, bảo vệ chống lại ánh sáng không phù hợp của các hóa chất và tất cả các pha loãng được ghi nhận chính xác.

Bộ dụng cụ huỳnh quang kế chứa đầy đủ vật liệu và vật tư cần thiết để đo huỳnh quang

Phần lớn các bộ dụng cụ đo huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm huỳnh quang nồng độ cao, bộ đệm đo và tiêu chuẩn tham chiếu. Ống, thẻ giao thức hoặc thiết lập xét nghiệm chuyên dụng cho thiết bị cũng được bao gồm trong một số bộ kit.

Hóa học thuốc nhuộm sẽ là yếu tố quyết định kết quả đo lường. Định lượng chọn lọc dsDNA nên được thực hiện trên bộ kit DNA hai sợi. RNA, DNA sợi đơn và các xét nghiệm protein dựa trên hóa học liên kết khác nhau và không thể thay thế cho nhau.

Một ví dụ là các bộ kit thương mại cho dsDNA có thể bao gồm thuốc thử cô đặc, đệm pha loãng và tiêu chuẩn DNA pha loãng trước. Có các hệ thống khác cung cấp thuốc thử tương thích với máy huỳnh quang một ống hoặc microplate với bước sóng kích thích và phát xạ phù hợp.

Đôi khi, huỳnh quang tốt hơn hấp thụ tia UV

Việc ước lượng nồng độ axit nucleic bằng quang phổ UV dựa trên khả năng hấp thụ ở 260 nm. Nó nhanh và hữu ích cho tỷ lệ tinh khiết nhưng muối, nucleotide tự do, protein, RNA, DNA và các hợp chất hữu cơ khác có thể dẫn đến tín hiệu hấp thụ.

Các xét nghiệm huỳnh quang được thiết kế để đặc hiệu hơn với một chất phân tích được chọn. Điều này có thể giúp tăng độ chính xác của nồng độ thấp hoặc mẫu có thể chứa các chất ô nhiễm tiềm ẩn. Do đó, định lượng huỳnh quang có thể nhạy và chọn lọc hơn so với hấp thụ tia UV đối với việc đo DNA, RNA hoặc protein cụ thể.

Cả hai phương pháp đều có thể kết hợp với nhau. Huỳnh quang có thể được sử dụng để đo nồng độ của một mục tiêu nhất định và hấp thụ tia UV có thể cung cấp phép đo độ tinh khiết tổng quát hơn.

Chọn bộ dụng cụ cho phân tích và phạm vi đo.

Có một số loại bộ dụng cụ đo huỳnh quang phổ biến, chẳng hạn như:

• Xét nghiệm dsDNA độ nhạy cao
• Xét nghiệm dsDNA phạm vi rộng
• Các xét nghiệm RNA
• xét nghiệm ssDNA
• Xét nghiệm protein
• Xét nghiệm chất lượng RNA

Các chiết xuất nồng độ thấp và thư viện giải trình tự đã chuẩn bị có thể được phát hiện bằng phương pháp thử nghiệm độ nhạy cao. Các xét nghiệm trong phạm vi hẹp phù hợp hơn với mẫu có nồng độ cao. Các mẫu ngoài phạm vi đã xác thực sẽ cần được pha loãng hoặc kết quả có thể kém tin cậy hơn.

Phạm vi định lượng giữa bộ kit độ nhạy cao và bộ kit phạm vi rộng có thể khác nhau và áp dụng cho cùng một chất phân tích. Do đó, xét nghiệm nên được lựa chọn dựa trên nồng độ dự kiến, chứ không chỉ dựa trên tên mẫu.

Bộ kit cũng cần tương thích với máy đo huỳnh quang. Xác minh các kênh kích thích và phát xạ, định dạng ống/tấm, thể tích mẫu, phương pháp hiệu chuẩn và các tùy chọn kiểm tra đã lập trình. Các giao thức cụ thể có thể được lập trình sẵn vào một số máy huỳnh quang để phân tích dsDNA, RNA và ssDNA, số khác có thể được lập trình riêng.

Viết các định nghĩa cho Khối lượng mẫu và Khối lượng thông lượng

Thể tích nhỏ hữu ích nếu mẫu khó thu thập hoặc cần bảo quản cho các thí nghiệm sau. Một số hệ thống đo huỳnh quang trên bàn cần vài microlit, nhưng thường mẫu được cho vào dung dịch làm việc lớn hơn.

Tốc độ thông lượng cũng là một yếu tố quan trọng. Đối với các phép đo thỉnh thoảng và các lô nhỏ, một máy đo huỳnh quang một ống có thể phù hợp. Một thiết bị hoặc quy trình vi tấm có thể xử lý nhiều mẫu chiết xuất hoặc nhiều thư viện giải trình tự có thể được ưu tiên cho các phòng thí nghiệm có nhiều mẫu.

Không phải nhạc cụ nào cũng thực dụng nhất. Một hệ thống tốt nên giảm thiểu việc hút thuốc lặp đi lặp lại, làm cho việc chuẩn bị thường xuyên trở nên dễ dàng hơn và phù hợp với số lượng mẫu thực tế mà phòng thí nghiệm sẽ xử lý thường xuyên.

Để theo dõi quy trình làm việc xét nghiệm nhất quán

Sau đây là một giao thức tiêu chuẩn của bộ kit huỳnh quang:

• A. Giải pháp hoạt động đã được chuẩn bị. Một giải pháp hoạt động đã được tạo ra.
• Đặt ra các tiêu chuẩn cần thiết
• Thêm từng mẫu chưa biết
• Trộn trộn kỹ các mẫu và tiêu chuẩn với nhau
• Ủ trong khoảng thời gian quy định
• Ngăn ngừa phản ứng do tiếp xúc không phù hợp với ánh sáng
• Sử dụng thước để đo chiều rộng và chiều dài của não.9. Đo não chính xác bằng thước kéo.
• Ứng dụng hệ số pha loãng của mẫu

Sử dụng pipette hiệu chuẩn để chuẩn bị và sử dụng tiêu chuẩn cũng như mẫu theo cùng một cách. Nếu bước hút hút được thực hiện với thể tích thấp, một sai sót nhỏ về thể tích có thể tạo ra sự khác biệt đáng kể về nồng độ cuối cùng.

Thời gian ấp cũng rất quan trọng. Lấy một mẫu ngay từ đầu, rồi lấy mẫu khác muộn hơn nhiều, có thể gây ra những biến động không cần thiết. Một số xét nghiệm cũng nhạy cảm với sự chênh lệch nhiệt độ giữa các tiêu chuẩn và mẫu.

Sử dụng tiêu chuẩn, phông trống và sao chép phù hợp

Tiêu chuẩn được sử dụng để liên hệ lượng chất phân tích với cường độ huỳnh quang. Chúng nên được trộn đều, dán nhãn đúng cách và tránh bị nhiễm bẩn.

Khi một mẫu chưa xác định được đưa vào phôi, tín hiệu đo được là do thuốc thử, bộ đệm, ống hoặc ma trận mẫu nền. Các phép đo lặp lại hữu ích nếu mẫu có giá trị, nồng độ chính xác gần với giới hạn xét nghiệm hoặc kết quả bất ngờ sẽ ảnh hưởng đến quá trình hạ nguồn tốn kém.

Nếu có các giá trị trùng lặp mà không trùng khớp, đừng chỉ tính trung bình của hai giá trị đó. Kiểm tra độ chính xác của ống hút thuốc, cách trộn mẫu, sự hiện diện của bọt khí, độ sạch của ống, thời gian ủ, nhiệt độ và phạm vi đo đã chọn.

Nam và nữ có cách đo đau khác nhau

Một số lý do phổ biến dẫn đến kết quả huỳnh quang không đáng tin cậy bao gồm:

• Lựa chọn nhầm xét nghiệm cho mục tiêu
• Chọn phạm vi độ nhạy không phù hợp
• Không sử dụng đúng loại hộp để bảo quản và chuẩn bị
• Thêm các thể tích mẫu không nhất quán
• Sự hiện diện của các chất ô nhiễm trong tiêu chuẩn hoặc dung dịch làm việc.
• Bẫy để lại bọt khí trong đường đi quang học.
• Cấm sử dụng ống bị trầy xước hoặc không tương thích. Không được phép sử dụng ống bị trầy xước hoặc không tương thích.
• Tiếp xúc quá mức với các hóa chất nhạy cảm với ánh sáng
• Đừng cho rằng số lượng tế bào trong một mẫu bị giảm do pha loãng.
• Sử dụng thiết bị ngoài phạm vi của thiết bị đã được xác thực.

Mẫu cô đặc cũng có thể làm nhiễm bẩn pipette hoặc khu vực làm việc, và ảnh hưởng đến các mẫu có nồng độ thấp trong tương lai. Điều này được giảm thiểu nhờ đầu bút mới, bề mặt làm việc sạch sẽ và chuỗi mẫu hợp lý.

Kết nối Đo lường với Quy trình làm việc Hạ nguồn bằng cách kéo nó vào Quy trình làm việc Hạ nguồn

Bộ dụng cụ huỳnh quang kế thường được sử dụng trước khi thực hiện PCR, qPCR, nhân bản, chuẩn bị thư viện giải tự, điện di, chuyển mạch và các quy trình khác liên quan đến việc kiểm soát lấy mẫu.

Định lượng rất quan trọng để chuẩn hóa mẫu, so sánh hiệu suất chiết xuất và nhận được đầu vào phản ứng nhất quán. Các xét nghiệm RNA (dựa trên huỳnh quang) được áp dụng trước các ứng dụng khác như RT-PCR và chuẩn bị thư viện DNA; Định lượng DNA được ứng dụng trong nhiều ứng dụng tiếp theo như PCR, nhân bản, chuyển gen và giải trình tự thế hệ mới.

Do đó, việc lựa chọn bộ kit nên tập trung vào quyết định được đưa ra sau khi đo. Có thể sử dụng xét nghiệm phạm vi rộng trong kiểm tra chiết xuất định kỳ, và một xét nghiệm nhạy hơn cho công việc giải trình tự đầu vào thấp.

Luôn giữ và xử lý hóa chất một cách phù hợp

Hóa chất huỳnh quang có thể nhạy cảm với ánh sáng, nhiệt độ và cách xử lý. Bảo quản, làm nóng, trộn và bảo quản theo hướng dẫn của bộ kit. Không phải tất cả các loại thuốc nhuộm huỳnh quang đều có thể đông lạnh, bảo quản ở nhiệt độ phòng hoặc tiếp xúc với ánh sáng phòng thí nghiệm.

Đánh dấu rõ ràng các giải pháp đang hoạt động và nhớ ghi lại ngày chúng được tạo ra. Trước khi nghi ngờ các mẫu gốc đã thay đổi, hãy kiểm tra tuổi hóa chất, lịch sử lưu trữ hóa chất, tiêu chuẩn, ống hút nước, thiết lập thiết bị, nhiệt độ và khả năng tương thích của ống.

Kết thúc

Bộ dụng cụ huỳnh quang rất nhạy và chọn lọc để phát hiện định lượng DNA, RNA hoặc protein, đặc biệt trong các mẫu giá trị hoặc loãng. Việc đo lường đáng tin cậy đòi hỏi xét nghiệm phải phù hợp với phạm vi chất phân tích và nồng độ, sử dụng máy đo huỳnh quang phù hợp, chuẩn bị tiêu chuẩn nhất quán và kiểm soát toàn bộ quy trình.

Không phải bộ kit có giới hạn phát hiện thấp nhất được ghi là tốt nhất. Đó là loại mẫu phù hợp với loại mẫu, công suất, ứng dụng tiếp theo và yêu cầu kiểm soát chất lượng của phòng thí nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1. Ứng dụng của Bộ Kit Huỳnh quang là gì?

Có nhiều bộ kit khác nhau dành cho kiểm tra chất lượng dsDNA, ssDNA, RNA và một số kiểm tra chất lượng RNA. Hóa học của phương pháp sàng lọc nên phù hợp với mục tiêu.

Câu hỏi 2. Bộ dụng cụ đo huỳnh quang hay phương pháp UV hiệu quả hơn?

Chúng thường đặc thù và nhạy cảm hơn với một chất phân tích cụ thể. Độ hấp thụ tia UV vẫn có thể được coi là hợp lệ cho kiểm tra độ tinh khiết bán cuối và đo độ tinh khiết tổng thể của mẫu.

Câu hỏi 3. Bạn cần bao nhiêu mẫu?

Âm lượng sẽ khác nhau tùy theo từng loại xét nghiệm và dụng cụ! Thực tế, có rất nhiều hệ thống trên bàn có sẵn, chỉ cần vài microlit mẫu gốc.

Câu hỏi 4. Thuốc thử được sử dụng để kiểm tra DNA RNA là gì?

Thường thì không chọn lọc. Trong ứng dụng thông thường, người ta có thể muốn đo hàm lượng DNA và/hoặc RNA, do đó, một xét nghiệm có thể đặc thù cho một hoặc cả hai.

Câu hỏi 5. Nguyên nhân của sự khác biệt trong kết quả từ các lần lặp khác nhau là gì?

Những lỗi này thường do lỗi pipette, trộn không đủ, bong bóng, nhiễm bẩn, sai số nhiệt độ hoặc phạm vi đo lường.