Thụ thể liên kết protein G: Từ tín hiệu tế bào đến phát hiện thuốc

Thụ thể liên kết protein G, hay gọi tắt là GPCR, là các protein màng giúp tế bào phản ứng với tín hiệu từ bên ngoài tế bào. Những tín hiệu này có thể bao gồm hormone, chất dẫn truyền thần kinh, lipid, peptide cũng như ánh sáng.

Mặc dù có sự tương đồng rõ ràng về cấu trúc trong cấu trúc bảy lớp xuyên màng của GPCR, chúng không hoạt động theo cùng một cách. Kết quả của thí nghiệm có thể phụ thuộc vào ligand của thụ thể, môi trường tế bào, mức độ biểu hiện của thụ thể và các đối tác truyền tín hiệu.

Do đó, các nhà nghiên cứu phải vượt ra ngoài việc đo lường sự "kích hoạt" thụ thể của một hợp chất để giải mã sinh học GPCR. Tất cả các quy trình, thời gian, định dạng xét nghiệm, kiểm soát và mô hình tế bào đều rất quan trọng.

G Protein Coupled Receptor: Nó là gì?

Số lần một GPCR điển hình đi qua màng tế bào là 7 lần. Các phần ngoại bào của nó liên kết với các phân tử tín hiệu và các phần nội bào liên kết với các protein G, các arrestin, kinase và các phân tử tín hiệu khác.

GPCR được phân loại thành nhiều lớp chính theo Hướng dẫn Dược lý IUPHAR/BPS, như các thụ thể lớp A, lớp B, lớp C, thụ thể dạng xù và thụ thể dính. Loại A là lớn nhất, liên quan đến các mục tiêu nổi tiếng như thụ thể adrenergic, dopamine, opioid và muscarinic.

Mặc dù cấu trúc tương tự, GPCR có thể nhận diện một tập hợp tín hiệu rất đa dạng. Điều này cho phép họ tham gia vào các cảm nhận cảm giác, điều hòa tim mạch, trao đổi chất, chức năng miễn dịch, tâm trạng, vận động và nhiều hơn thế nữa.

GPCR được kích hoạt như thế nào?

Một ligand gắn vào thụ thể và khiến thụ thể thay đổi hình dạng. Do sự thay đổi cấu hình này, thụ thể có thể tương tác với protein tín hiệu nội bào.

Nhiều GPCR có protein G dị tam giác làm đối tác đầu tiên gồm các tiểu đơn vị alpha, beta và gamma. Việc kích hoạt các thụ thể dẫn đến việc trao đổi GDP lấy GTP trong tiểu đơn vị alpha. Các thành phần được kích hoạt sau đó ảnh hưởng đến các enzyme hạ nguồn, kênh ion và chất truyền tin thứ hai.

Các họ protein G phổ biến nhất là:

• Gs, điều này thường gây tăng AMP chu kỳ
• Tên gọi phổ biến cho enzyme giảm AMP vòng là gi/o.
• Con đường Gq/11 báo hiệu các con đường phospholipase C và canxi
• Phản ứng của protein và bộ xương tế bào họ Rho có thể được kiểm soát bằng G12/13.

Mô tả theo sách giáo khoa này rất hữu ích, nhưng một đường thẳng là một hình thức tín hiệu hiếm gặp! Một thụ thể đơn lẻ có thể truyền tín hiệu qua nhiều protein G và cách truyền tín hiệu tối ưu có thể thay đổi tùy thuộc vào ligand và loại tế bào. GPCRdb đề cập rằng các thụ thể có thể tương tác với protein G, các kinase GPCR và arrestin, dẫn đến sự hình thành nhiều con đường tín hiệu nội bào.

Vai trò của arrestin

Khi protein G đã được kích hoạt, tín hiệu của GPCR không dừng lại.

Các kinase GPCR có khả năng phosphoryl hóa các thụ thể đã được kích hoạt. Các arrestin sau đó có thể tương tác với thụ thể, ức chế sự liên kết tiếp theo của thụ thể với protein G, hỗ trợ nội hóa thụ thể và tham gia vào các con đường truyền tín hiệu khác.

Do đó, việc tuyển dụng arrestin không thể được coi là "công tắc tắt". Tùy vào thụ thể và thí nghiệm, nó có thể ảnh hưởng đến việc vận chuyển, giảm mẫn, tái chế, phân hủy thụ thể hoặc điều chỉnh các tác động khác về sau.

Vì cả tín hiệu protein G và việc thu hút arrestin đều là các chỉ số quan trọng về dược lý hoàn chỉnh của một hợp chất, nên chúng thường được đo cùng nhau.

Các bài viết trong phần này xem xét cách mà cùng một thụ thể có thể dẫn đến các phản ứng khác nhau

GPCR không chỉ là công tắc bật/tắt.

Có thể tìm thấy nhiều ligand khác nhau liên kết với các pha cấu hình khác nhau của thụ thể. Một loại ligand có thể gây kích hoạt cao trên một con đường protein G, trong khi con đường kia có thể gây ra nhiều hơn việc thu hút arrestin hoặc có cấu trúc tín hiệu khác nhau. Nó thường được gọi là tính chọn lọc chức năng/tín hiệu thiên lệch.

Phông nền của các ô cũng rất quan trọng. Cùng một thụ thể có thể được tìm thấy trong hai phòng thí nghiệm khác nhau, nhưng có lượng protein G, arrestin, kinase, enzyme hoặc thụ thể nội sinh khác nhau trong tế bào.

Một vấn đề khác có thể là mức độ biểu hiện của các thụ thể. Biểu hiện quá mức có thể tăng cường phản ứng với mức hoạt động thấp và/hoặc thay đổi sở thích liên kết, đồng thời cũng có thể khiến chất chủ vận một phần hoạt động mạnh hơn trong tế bào so với mô tự nhiên.

Do đó, kết quả nên được xem là chỉ dẫn hành vi của một hệ thống thí nghiệm hoàn chỉnh chứ không chỉ riêng thụ thể.

Chọn xét nghiệm dựa trên câu hỏi sinh học

Không có một bài kiểm tra GPCR nào có thể trả lời tất cả các câu hỏi.

Xét nghiệm cAMP

Các thụ thể có protein Gs hoặc Gi thường được đo bằng cAMP. Đáp ứng Gs có thể dẫn đến tăng cAMP và đáp ứng Gi có thể được biểu thị bằng việc ức chế sản xuất cAMP bị kích thích.

Các xét nghiệm này thường được sử dụng trong các nghiên cứu đáp ứng nồng độ, nghiên cứu đặc trưng chất chủ vận và nghiên cứu đối kháng. Trong các thí nghiệm đối kháng, nồng độ chất chủ vận thường được thêm vào sau khi hợp chất thử nghiệm tiếp xúc với tế bào.

Xét nghiệm canxi

Các thụ thể liên kết Gq có thể được nghiên cứu bằng các xét nghiệm canxi nội bào. Chúng có thể cho kết quả đọc nhanh và tốc độ cao, nhưng phản ứng có thể ngắn và phụ thuộc nhiều vào cách xử lý tế bào, tải thuốc nhuộm, biểu hiện thụ thể và thời gian đo.

Liên kết GTPγS

Các xét nghiệm GTPγS là một trong những sự kiện sớm nhất được đo trong quá trình kích hoạt protein G và thường được sử dụng để xác nhận hoạt động của chất chủ vận trong các chế phẩm màng. Vì xét nghiệm nằm khá gần tương tác giữa thụ thể và protein G, nó có thể giảm một số sự khuếch đại trong các kết quả đọc sau.

Tuyển dụng Arrestin

Các xét nghiệm arrestin có thể được sử dụng để điều tra sai lệch con đường, tín hiệu đặc hiệu với ligand, vận chuyển thụ thể và giảm nhạy cảm với thụ thể. Chúng tốt nhất nên được sử dụng kết hợp với xét nghiệm protein G chứ không phải như một chỉ báo chung về sự kích hoạt của thụ thể.

Cảm biến sinh học tế bào sống

Kỹ thuật BRET và FRET (cùng các phương pháp cảm biến sinh học khác) có thể theo dõi các sự kiện tín hiệu trong tế bào sống theo thời gian. Điểm bán hàng lớn nhất của nó là thông tin động học: các nhà nghiên cứu có thể đo khi tín hiệu bắt đầu, khi nó đạt đỉnh rồi giảm, vì họ đo được nhiều hơn một điểm đầu.

Thực hiện một thí nghiệm GPCR chính xác

Một xét nghiệm tốt dựa trên sinh học chứ không phải dụng cụ.

Trước tiên, hãy đảm bảo rằng thụ thể được biểu hiện và nằm đúng vị trí trong màng tế bào. Phản ứng thấp có thể không phải do hoạt tính thấp của ligand, mà là do biểu hiện/vận chuyển thụ thể kém.

Thứ hai, thêm các thiết bị điều khiển phù hợp. Thông thường, có thể cần một chất chủ vận đã biết, một chất đối kháng đã biết, các bộ điều khiển bằng phương tiện, các tế bào chưa truyền và một bộ kiểm soát độc lập với thụ thể cho quá trình xét nghiệm phía sau.

Cuối cùng, thực hiện một đường cong nồng độ-đáp ứng đầy đủ. Việc đánh giá chỉ một nồng độ của một hợp chất sẽ không phải là thước đo đáng tin cậy về độ mạnh, hiệu quả, chủ vận một phần, độc tính hoặc sự can thiệp không đặc hiệu với xét nghiệm.

Việc chuẩn hóa thời gian cũng là điều cần thiết. Khi bạn nhận được tín hiệu canxi, chỉ trong vài giây, rồi vài giờ sau bạn đo được biểu hiện gen, bạn không thể đơn giản so sánh hai thứ đó. Các xét nghiệm đo cùng một thụ thể có thể được sử dụng để đo các pha khác nhau của phản ứng.

Cuối cùng, xác thực kết quả đáng kể bằng phương pháp trực giao. Nếu một hợp chất được phát hiện hoạt động trong xét nghiệm cAMP, tốt nhất nên xác nhận bằng một xét nghiệm hữu ích khác, xét nghiệm liên kết hoặc bằng một đối chứng dương tính đặc hiệu với thụ thể. Sổ tay Hướng dẫn Xét nghiệm đề xuất rằng việc xác thực cẩn thận, kiểm soát chất lượng và đặc trưng dược lý các kết quả GPCR trong hướng tới tối ưu hóa khách hàng tiềm năng sẽ được khuyến nghị.

GPCR cho Khám phá Thuốc

GPCR tiếp tục đóng vai trò then chốt trong phát hiện thuốc vì chúng tham gia vào nhiều khía cạnh sinh lý học và được biểu hiện trên bề mặt tế bào. GPCRdb ước tính rằng 25% hormone ở người liên quan đến các thành viên của họ thụ thể này, và khoảng 1/3 tổng số thuốc nhắm vào các thành viên của họ thụ thể này.

Đối với các chương trình truyền thống, mục tiêu tìm kiếm chính là các chất chủ vận hoặc chất đối kháng liên kết với vị trí liên kết ligand chính. Nghiên cứu về các chất điều biến allosteric, ligand thiên đường dẫn, độ chọn lọc thụ thể – cảm biến, động học liên kết và thiết kế hợp chất dựa trên cấu trúc cũng đang được nghiên cứu.

Với sự xuất hiện của sinh học cấu trúc, điều này trở nên khả thi hơn. GPCRdb hiện bao gồm các công cụ để so sánh vị trí liên kết và trạng thái hoạt hóa của GPCR, bao gồm cấu trúc thụ thể, phức hợp thụ thể–ligand và phức hợp protein thụ thể–G.

Một hợp chất có cấu trúc tốt nên được kiểm tra chức năng ngay cả khi có cấu trúc tốt. Một phân tử có thể liên kết với một mục tiêu phù hợp với ái lực liên kết mạnh mà không kích hoạt phản ứng tế bào mong muốn, hoặc ngược lại, một phân tử có thể tham gia vào con đường mong muốn nhưng không đúng cách.

Kết thúc

Các thụ thể liên kết protein G nên được xem không chỉ là một công tắc màng mà còn là một hệ thống tín hiệu linh hoạt.

Thụ thể thay đổi hình dạng khi liên kết ligand, thụ thể tìm bạn đồng hành trong tế bào và môi trường của tế bào quyết định hướng đi của tín hiệu. Đó là lý do tại sao việc cân nhắc lựa chọn xét nghiệm, biểu hiện của các thụ thể, thời điểm của con đường, các biện pháp kiểm soát và xác thực trực giao là rất quan trọng.

Kết luận tốt nhất cho nghiên cứu GPCR và phát hiện thuốc thường được đưa ra nhờ sự kết hợp giữa thông tin cấu trúc và nhiều hơn một bài kiểm tra chức năng.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1. Chức năng chính của GPCR là gì?

GPCR là một thụ thể bề mặt tế bào phản ứng với tín hiệu ngoại bào và tạo ra phản ứng nội bào. Câu trả lời có thể là thông qua protein G, arrestin, chất truyền thứ hai, kênh ion hoặc điều hòa gen.

Câu hỏi 2. Tất cả các GPCR đều được kích hoạt bởi cùng một loại protein G không?

Không. Nhiều thụ thể khác nhau có thể thích kích hoạt các protein G khác nhau (Gs, Gi/o, Gq/11, G12/13 hoặc nhiều đối tác tín hiệu).

Câu hỏi 3. GPCR Mồ côi là gì?

GPCR mồ côi là một thụ thể mà ligand kích hoạt tự nhiên không chắc chắn. Những thụ thể này vẫn có ý nghĩa lớn đối với nghiên cứu cơ bản và phát triển thuốc.

Câu hỏi 4. Vậy, nên dùng xét nghiệm nào cho sàng lọc GPCR?

Xét nghiệm "tốt nhất" sẽ phụ thuộc vào câu hỏi cần giải quyết và con đường tín hiệu của thụ thể. Các khía cạnh khác nhau của phản ứng có thể được đo bằng các xét nghiệm cAMP, canxi, GTPγS, arrestin và các xét nghiệm cảm biến sinh học tế bào sống.

Câu hỏi 5. Lý do gì khiến các nhà nghiên cứu sử dụng nhiều hơn một xét nghiệm?

Một xét nghiệm chỉ đo được một đường dẫn hoặc có các giao thoa đặc thù theo định dạng. Nếu có thể chứng minh bằng phép đo trực giao rằng hiệu ứng quan sát được thực sự liên quan đến thụ thể, thì có thể kết luận đây thực sự là một tác động của thụ thể.