Bộ chiếu sáng UV: Lựa chọn và sử dụng hệ thống phù hợp để hiển thị gel

Kết quả là có vấn đề với đèn xuyên UV. Nó đọc DNA, RNA hoặc các dải protein một cách đơn giản, bằng cách cho tia cực tím đi qua gel nhuộm. Người vận hành sau đó có thể kiểm tra gel, chụp ảnh hoặc cắt vòng mong muốn để làm việc với nó sau này.

Hầu hết các vấn đề đều liên quan đến các vấn đề khác ngoài công tắc nguồn. Nguyên nhân là do bước sóng không đúng, ánh sáng và màu không tương thích, phơi sáng quá lâu và thiếu khả năng bảo vệ tia UV.

Quy trình làm việc của bộ chiếu sáng xuyên UV tốt nên cung cấp các dải sáng trong suốt, chỉ với lượng phơi sáng tối thiểu đến mẫu và người sử dụng thiết bị.

Cách hoạt động của bộ chiếu sáng UV Transilluminator

Gel sau đó được điện di hóa, để lại các mảnh phân tử thường không thể nhìn thấy bằng mắt thường. Một loại nhuộm huỳnh quang bám vào hoặc tương tác với vật liệu cần nhuộm. Gel đã nhuộm sau đó được chuyển lên bề mặt được chiếu sáng và thuốc nhuộm được kích thích bởi ánh sáng tử ngoại, phát ra ánh huỳnh quang có thể nhìn thấy bằng mắt.

Nền tối và các dải sáng cho phép bạn ước lượng kích thước các mảnh, so sánh cường độ mẫu, kiểm tra sản phẩm khuếch đại hoặc tìm vật liệu để chiết xuất gel.

Có một số thiết bị chiếu sáng UV với bước sóng tiêu chuẩn 254, 302 và 365 nm. Một số cung cấp một bước sóng duy nhất, số khác cung cấp hai hoặc ba bước sóng; Cái nào tốt nhất phụ thuộc vào loại thiết bị và bước sóng mong muốn. Ứng dụng quan sát gel và điện di sử dụng dải UV rộng rãi gần 302 nm.

Chọn bước sóng cho ứng dụng thực tế

Cường độ huỳnh quang, tổn thương mẫu và khả năng tương thích với màu đều bị ảnh hưởng bởi việc chọn bước sóng.

Nguồn 302 nm thường được sử dụng khi xem các gel DNA và RNA nhuộm huỳnh quang vì nó thường cho ra tín hiệu cường độ cao và nhiều loại nhuộm axit nucleic đã biết có thể được sử dụng với nguồn này. Giải pháp dễ dàng cho việc kiểm tra gel định kỳ và ghi chép tài liệu.

Nếu việc giảm tổn thương DNA do tia UV quan trọng hơn tín hiệu mạnh nhất có thể, có thể xem xét sử dụng tia UV sóng dài, gần 365 nm. Thermo Fisher khuyên nên giảm thiểu tiếp xúc với DNA và đề xuất sử dụng bước sóng dài hơn (khoảng 360 nm) nếu DNA sẽ được thu hồi từ gel.

Việc sử dụng tia UV sóng ngắn (gần 254 nm) để quan sát thường xuyên các gel DNA không nên được coi là tự động, mặc dù có một số thiết bị chiếu sáng trong phòng thí nghiệm. Sản phẩm phù hợp để sử dụng tùy thuộc vào vật liệu huỳnh quang và ứng dụng trong phòng thí nghiệm.

Bước sóng lớn nhất do đó không phải là lựa chọn hiệu quả nhất. Đây là loại phù hợp với màu và giữ mẫu đủ tốt cho bước tiếp theo.

Sử dụng màu gel khác cho nguồn sáng có màu khác

Đèn chiếu sáng và gel nhuộm nên được xem là một hệ thống quang học duy nhất.

Có nhiều loại thuốc nhuộm với đặc tính kích thích và phát xạ khác nhau. Một màu có thể có độ phản xạ UV cao, phản xạ ánh sáng xanh thấp, và ngược lại. Bộ lọc camera cũng nên cho phép ánh huỳnh quang phát ra đi qua và ngăn bức xạ kích thích không mong muốn đi qua.

Trước khi tiến hành xét nghiệm mới:

• Bước sóng kích thích vết nhuộm là lequel. Các bước sóng kích thích vết nhuộm là 'luequels'.
• Quyết định sử dụng bộ lọc nhiếp ảnh hay không sẽ do từng nhiếp ảnh gia quyết định.
• Các thuộc tính của chất nhuộm (DNA, RNA hoặc protein)
• Nếu gel có được cắt hay không, thì sẽ ghi chép như thế nào?
• Nếu nguồn sáng là công nghệ mới, có phương pháp nào để ghi lại nó bằng hệ thống hình ảnh hiện tại không?

Ví dụ, gel nhuộm SYBR Safe có thể được chụp bằng thiết bị huỳnh quang phù hợp với bộ lọc tia UV hoặc ánh sáng xanh dương - bộ lọc dùng cho hình ảnh ethidium-bromide có thể không phù hợp.

Nếu hình ảnh quá mờ, không nhất thiết có nghĩa là gel có quá ít DNA. Nguyên nhân có thể là bước sóng kích thích không phù hợp, bộ lọc camera sai, đèn UV đã qua sử dụng đã lỗi thời hoặc ánh sáng phòng quá nhiều.

Nếu tổn thương DNA được phục hồi, hãy hạn chế tiếp xúc với tia UV

Axit nucleic dễ bị tổn thương bởi tia UV. Điều này rất quan trọng nếu nhà nghiên cứu muốn tách một dải DNA từ gel và sử dụng phần DNA còn lại trong các ứng dụng tiếp theo như nhân bản, liên kết, giải trình tự hoặc các ứng dụng khác.

Tiếp xúc lâu dài có thể dẫn đến vết xước DNA cũng như các tổn thương khác, ảnh hưởng đến chất lượng DNA thu hồi. Tiếp xúc với tia UV trong thời gian dài có thể gây tổn thương DNA, ảnh hưởng đến các ứng dụng tiếp theo như nhân bản con, Thermo Fisher chỉ ra.

Trong trường hợp cần trực quan hóa UV:

1. Chuẩn bị dụng cụ cắt và ống thu trước khi bật đèn.
   1. Đặt mức thấp nhất để tạo ra dải trong suốt.
   1. Việc tiếp xúc nên được giữ ở mức tối thiểu.
   1. Nếu có thể, hãy nghĩ đến bước sóng dài hơn cho ánh sáng UV.
   1. Không nên xem đi xem lại cùng một loại gel.
   1. Ghi chú lại dải tần đã chọn và tắt nguồn phát đi.

Một bộ chiếu sáng ánh sáng xanh tương thích với nhân bản có thể phù hợp hơn cho công việc nhân bản đặc biệt nhạy. Màu sắc có thể bị kích thích bởi ánh sáng xanh, và ít tổn thương hơn được phát hiện đối với DNA do ánh sáng xanh gây ra.

Kiểm tra độ đồng đều của chiếu sáng

Bộ chiếu sáng xuyên qua nên cung cấp ánh sáng đồng đều cho khu vực cần xem.

Nếu một bên của bề mặt có cường độ cao hơn bên kia, các dải màu giống nhau sẽ có cường độ khác nhau tùy thuộc vào vị trí của chúng trên gel. Điều này đặc biệt quan trọng khi các làn được so sánh trong cùng một phòng thí nghiệm và/hoặc khi hình ảnh được sử dụng cho phân tích bán định lượng.

Độ đồng đều này phụ thuộc vào tình trạng đèn, cách bố trí đèn, bộ lọc, độ sạch của bề mặt và thiết kế quang học của thiết bị. Chiếu sáng đồng đều rất quan trọng trong bối cảnh UVP để đạt được khả năng lặp lại kết quả ở các dải và làn khác nhau.

Luôn kiểm tra nền để xem nó có đều trên toàn bộ gel trước khi tùy thuộc vào độ mạnh của dải gel. Chuyển cùng một gel sang một phần khác trên bề mặt có thể giúp phát sinh vấn đề về ánh sáng.

Sử dụng khu vực quan sát phù hợp

Diện tích mặt bàn được chiếu sáng nên đủ để phủ gel nhưng không chiếm thêm không gian bàn.

Một tế bào nhỏ rất phù hợp cho các loại mini-gel tiêu chuẩn. Bệ lớn hơn sẽ phù hợp hơn cho gel kích thước lớn, hoặc nhiều gel đặt cạnh nhau. Có các hệ thống thương mại với các vùng chiếu sáng khác nhau, thường khoảng 20 x 20 cm trở lên.

Tất cả gel nên phẳng trên bề mặt. Có thể xảy ra hiện tượng phản chiếu và mờ trên các dải do nếp nhăn trên màng bảo vệ, lớp đệm quá nhiều hoặc khay không đều.

Đảm bảo bề mặt quan sát sạch sẽ; Chỉ sử dụng vật liệu và chất tẩy rửa tương thích với bộ lọc UV. Hình ảnh có thể bị ảnh hưởng bởi vết xước, vết bẩn hoặc lớp đệm khô.

Đảm bảo bảo vệ người dùng khỏi ánh sáng UV

Đèn chiếu sáng UV không phải là đèn quan sát tiêu chuẩn, mà là nguồn sáng cường độ cao được thiết kế để sử dụng trong phòng thí nghiệm.

Tiếp xúc trực tiếp hoặc gián tiếp với tia UV đều có thể gây tổn thương mắt và da. Hướng dẫn an toàn phòng thí nghiệm của Stanford liệt kê các biện pháp phòng ngừa khi sử dụng bộ chiếu sáng: kiểm soát việc tiếp cận bộ chiếu sáng khi sử dụng, tránh xa các bề mặt phản chiếu của bộ chiếu sáng, và đặt biển báo chỉ bảo vệ da và mắt.

Luôn sử dụng nắp bảo vệ, tấm chắn hoặc tủ hình ảnh đi kèm với thiết bị. Các phương pháp phòng thí nghiệm yêu cầu làm việc với gel có thể yêu cầu che mặt, đeo găng tay, mặc áo khoác phòng thí nghiệm cố định và phủ lên da bằng chất chống tia UV.

Đừng cho rằng kính bảo hộ thông thường sẽ chặn bước sóng UV. Mặc thiết bị bảo hộ phù hợp đã được chỉ định cho thiết bị và tuân thủ các quy định về an toàn bức xạ của phòng thí nghiệm.

Kiểm soát phơi sáng tốt hơn đạt được với hệ thống ghi chép gel kín với khóa an toàn thay vì làm việc trên hộp đèn mở. Một số hệ thống không cho phép mở cửa hình ảnh khi hoạt động ở chế độ UV.

Giáo viên nên thiết lập quy trình xem nhất quán

Có một đường đơn giản có thể dùng để giảm thiểu biến động không cần thiết:

• Điện di và nhuộm 1. Điện di và 1 nhuộm.
• Đảm bảo màu nhuộm có bước sóng phù hợp.
• Đảm bảo bên ngoài khay gel sạch và khô.
• Chọn bước sóng và cường độ UV yêu cầu.
• Trải gel lên khu vực quan sát ở giữa.
• Đóng tấm chắn bảo vệ/hộp hình ảnh.
• Sử dụng thời gian phơi sáng ngắn nhất có thể để tạo ra các dải hiển thị.
• Chụp ảnh bằng bộ lọc khí thải phù hợp.
• Tắt đèn UV khi di chuyển gel.
• Lau sạch bề mặt sau khi sử dụng.

Nếu thực hiện nhiều thí nghiệm, nồng độ màu nên giống nhau, cũng như bộ lọc hình ảnh, thời gian phơi sáng, cài đặt cường độ và điều kiện máy ảnh.

Cắm Transilluminator vào Quy trình làm việc Hình ảnh

Nếu người dùng không cần kiểm tra gel, thì có thể sử dụng bộ chiếu sáng trên bàn. Đối với các ứng dụng đòi hỏi cao hơn, cần có hệ thống tài liệu gel đầy đủ bao gồm camera, vỏ tối, bộ lọc và phần mềm phân tích hình ảnh.

Hệ thống tích hợp có thể được sử dụng để chụp ảnh, đo dải màu, ghi chép và phân tích gel định kỳ. Bio-Rad đặc trưng cho các nền tảng tài liệu gel, với hệ thống chiếu sáng kiểm soát và phần mềm tự động thu nhận và phân tích hình ảnh.

Quyết định sẽ phụ thuộc vào việc phòng thí nghiệm sẽ làm gì với hình ảnh. Trong phòng thí nghiệm nghiên cứu, phòng thí nghiệm giảng dạy có thể cần xác nhận trực quan rõ ràng, phòng thí nghiệm nghiên cứu có thể cần các tệp hình ảnh có thể truy vết, độ phơi nhiễm nhất quán và phân tích dải tần định lượng.

Không bao giờ tháo nguồn sáng

Ngay cả khi đèn UV trông như đang bật, chúng cũng bắt đầu giảm công suất theo thời gian. Khi giảm cường độ, người vận hành sẽ tăng thời gian phơi sáng, điều này có thể dẫn đến giảm độ đồng nhất và nhiều phơi nhiễm mẫu hơn.

Tuân thủ hướng dẫn bảo dưỡng bóng đèn của nhà sản xuất. Máy đo bức xạ UV sẽ là một phép đo khách quan hơn so với ước lượng trực quan và UVP đã xác định rằng đo bức xạ là phương pháp phù hợp để giám sát tuổi thọ hữu ích của nguồn UV.

Thay đổi đèn theo bộ nếu được khuyến nghị, vệ sinh kỹ bộ lọc quan sát và ghi chú ngày bảo dưỡng. Đèn UV huỳnh quang cũng có thể chứa thủy ngân và cần được xử lý, xử lý như chất thải nguy hại theo yêu cầu địa phương.

Kết thúc

Khi sử dụng bộ chiếu sáng UV để hiển thị gel, nó có thể làm nhanh chóng và rõ ràng, nhưng không thể chỉ sáng trong ánh sáng tử ngoại để đạt kết quả tốt.

Bước sóng nên phù hợp với việc nhuộm và các mục đích sử dụng phía sau. Ánh sáng nên đồng đều nhất có thể, thời gian phơi sáng nên ngắn nhất có thể, bộ lọc camera phải giống với ánh huỳnh quang phát ra, và người dùng nên được bảo vệ khỏi phơi nhiễm tia UV từ nguồn sáng.

Thiết bị phù hợp là thiết bị phù hợp với kích thước gel, phương pháp nhuộm, yêu cầu hình ảnh, quy trình thu hồi mẫu và các kiểm soát an toàn cho môi trường phòng thí nghiệm.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1. Bộ chiếu sáng UV được dùng để làm gì?

Nó chủ yếu được sử dụng để trực quan hóa các dải DNA, RNA hoặc protein được nhuộm huỳnh quang, gắn nhãn huỳnh quang trong các gel điện di. Nó cũng có thể được tích hợp vào hệ thống tài liệu gel.

Câu hỏi 2. Bước sóng nào sau đây thường được sử dụng cho DNA Gels?

Một ứng dụng phổ biến của tia UV trung bình (gần 302 nm) là để quan sát các gel định kỳ. Lựa chọn cuối cùng nên giống với màu nhuộm cũng như cách áp dụng sau đó.

Câu hỏi 3. Ánh sáng UV có làm biến đổi DNA không?

Đúng vậy. Tiếp xúc lâu dài có thể gây tổn thương DNA và giảm khả năng nhân bản DNA cũng như các ứng dụng tiếp theo.

Câu hỏi 4. Cái nào hiệu quả hơn: Ánh sáng xanh dương hay tia UV?

Nếu lo ngại về hư hại do tia UV và/hoặc tổn thương DNA, nên sử dụng ánh sáng xanh dương để tạo vết bẩn tương thích. Ngay cả với một số vết bẩn đã biết, tia UV cũng có thể tạo hiệu ứng kích thích tốt hơn.

Câu hỏi 5. Tại sao lại có điểm yếu ở Gel Bands?

Điều này có thể do nồng độ mẫu thấp, nhuộm không phù hợp, bước sóng hoặc bộ lọc không phù hợp, đèn đã cũ, quá nhiều ánh sáng nền hoặc nhuộm không tốt.