Hệ thống Hình ảnh Sinh học Phân tử: Lựa chọn nền tảng phù hợp cho gel và vết blot

Hệ thống hình ảnh sinh học phân tử cung cấp đầu ra số hóa của gel hoặc màng có thể quan sát, định lượng, lưu trữ và so sánh. Nó có thể được thiết lập để quét gel chứa DNA và RNA, gel protein nhuộm, các khối phát quang hóa học phương Tây, các khối huỳnh quang và các mẫu đo màu.

Một hệ thống nên được sử dụng để phù hợp với xét nghiệm, chứ không phải ngược lại.

Hệ thống Hình ảnh Sinh học Phân tử hoạt động như thế nào?

Một hệ thống hình ảnh tiêu chuẩn sẽ bao gồm buồng kín ánh sáng, camera, ống kính, tầng mẫu, nguồn sáng có thể dùng để kích thích mong muốn, bộ lọc cho phép chỉ truyền ánh sáng với tần số phát xạ nhất định, phần mềm cho camera ghi hình ảnh và phần mềm phân tích hình ảnh.

Đối với gel axit nucleic, thiết bị chiếu tia UV, xanh dương hoặc các ánh sáng phù hợp khác lên màu huỳnh quang. Ánh sáng trắng thường được sử dụng cho các gel protein có thể nhìn thấy. Ánh sáng tạo ra trong các vệt phát quang hóa học phương Tây là do chính chúng tạo ra và đến từ phản ứng hóa học, vì vậy cần có camera nhạy và buồng chụp ảnh tối, nhưng không cần cường độ ánh sáng cao trên mẫu.

Một số nền tảng tất cả trong một có khả năng ghi lại gel, hình ảnh màu sắc, phát quang hóa học và huỳnh quang trong một vỏ duy nhất. Ví dụ, bio-Rad cung cấp các hệ thống để chụp ảnh gel axit nucleic, protein và các khối phát quang hóa học, và các hệ thống này có thể được mở rộng với kênh nhìn thấy, kênh huỳnh quang đỏ xa và gần hồng ngoại.

Bạn có thể bắt đầu với các mẫu mà bạn chạy

Nơi đầu tiên để bắt đầu là trên bàn thí nghiệm—không phải trên bảng thông số kỹ thuật!

Đối với một phòng thí nghiệm giảng dạy tập trung chủ yếu vào gel agarose, hình ảnh UV, ánh sáng xanh và ánh sáng trắng có thể là những loại duy nhất cần thiết. Một phòng thí nghiệm nghiên cứu protein chính xác đòi hỏi khả năng phát quang hóa học tinh tế và một số kênh huỳnh quang.

Thermo Fisher chia các hệ thống trực quan hóa thành hai loại: hệ thống cung cấp trực quan hóa đơn giản và hệ thống phân tích phần mềm cũng như hình ảnh phát quang Western Blot hóa học và huỳnh quang đa kênh. Một lời nhắc hữu ích: hệ thống tài liệu gel không nhất thiết là một thiết bị như máy chụp phân tử đa chế độ.

Ghép nguồn kích thích và bộ lọc phù hợp với vết nhuộm

Mỗi loại thuốc nhuộm huỳnh quang có dải bước sóng tối ưu cho khả năng chiếu sáng và phát ra ánh sáng. Hệ thống hình ảnh phải được trang bị nguồn sáng phù hợp để kích thích thuốc nhuộm, và bộ lọc phát xạ cho phép photon phát xạ (huỳnh quang) đến được máy ảnh trong khi loại bỏ ánh sáng dùng để kích thích thuốc nhuộm.

Dưới đây là các ví dụ về các hệ thống có thể chứa:

• Chiếu sáng qua tia UV
• Chiếu sáng qua ánh sáng xanh
• Ánh sáng truyền qua màu trắng
• Ánh sáng phản chiếu màu trắng
• Kích thích huỳnh quang nhìn thấy được
• Kích thích huỳnh quang cận hồng ngoại

Không có mối tương quan giữa số lượng nguồn sáng và chất lượng của nó. Điều quan trọng là liệu các bước sóng và bộ lọc được lắp đặt có tương thích với các loại nhuộm, kháng thể và nhãn huỳnh quang đã được sử dụng trong phòng thí nghiệm hay không.

Kiểm tra danh sách thuốc thử của phòng thí nghiệm trước khi mua hệ thống để đảm bảo các ứng dụng hỗ trợ. Xin lưu ý rằng không phải tất cả các loại thuốc nhuộm huỳnh quang đều có thể được ghi nhận vì hệ thống này được gọi là "máy ảnh huỳnh quang".

Phát quang hóa học và huỳnh quang rất giống nhau

Trong phương pháp chặn phương Tây phát quang hóa học, ánh sáng được tạo ra bởi phản ứng phát quang hóa học, thường dựa trên enzyme kháng thể và nền phát quang. Tín hiệu sẽ thay đổi theo thời gian – việc chụp ảnh nên được bắt đầu trong phạm vi thời gian làm việc được khuyến nghị cho thuốc thử.

Ánh sáng huỳnh quang phương Tây thực hiện cần ánh sáng bên ngoài của sự kích thích. Nó có thể được sử dụng để đa kênh thí nghiệm, do đó nhiều mục tiêu có thể được phát hiện trên cùng một màng thông qua các kênh huỳnh quang khác nhau.

Phát quang hóa học thường được sử dụng để phát hiện nhạy và thường xuyên. Khi việc ghép kênh hoặc bắt tín hiệu ổn định hoặc so sánh định lượng là quan trọng, huỳnh quang thường được lựa chọn. Không có phương pháp duy nhất là tốt nhất, vì nó phụ thuộc vào yêu cầu của xét nghiệm, lượng mục tiêu, kháng thể, nhãn mác sử dụng và mục đích phân tích.

Nếu một phòng thí nghiệm thường xuyên tiến hành cả hai bài kiểm tra, họ nên đảm bảo rằng hệ thống đề xuất cho phép các bài kiểm tra được thực hiện nguyên trạng và không cần thay đổi phần cứng phức tạp.

Khi chụp ảnh, hãy cân nhắc dải động và độ bão hòa

Một số vết blot có thể có một dải rất mạnh, và một số dải yếu. Dải tần mạnh có thể bị bão hòa nếu thời gian phơi sáng đủ lâu để hiển thị các tín hiệu yếu.

Khi có quá nhiều ánh sáng đến mức các điểm ảnh của máy ảnh không thể ghi lại nữa. Sau thời điểm đó, độ rõ nét bề ngoài của dải hiển thị sẽ được giữ nguyên nhưng mức độ cường độ sẽ không thể dùng để so sánh định lượng.

Dải động là phạm vi các tín hiệu yếu đến mạnh mà hệ thống hình ảnh có thể ghi lại trong một hình ảnh duy nhất. Dải động lớn hơn giúp dễ dàng ghi lại các dải âm yếu và mạnh mà không mất thông tin.

Một số nền tảng hình ảnh có thể phát hiện điểm ảnh bão hòa, đề xuất phơi sáng phù hợp hoặc sử dụng nhiều lần phơi sáng. Chúng có thể giảm số lần chụp ảnh thử và sai, nhưng không nhằm thay thế cho một thiết kế thí nghiệm tốt. Ngay cả khi mẫu bị quá tải, chúng vẫn nên được hiệu chỉnh trong giai đoạn xét nghiệm và các tín hiệu kháng thể quá mạnh cũng nên được điều chỉnh.

Nên tránh sử dụng chế độ phơi sáng tự động

Phơi sáng tự động có thể hữu ích nếu nhiều người thay phiên nhau sử dụng thiết bị, hoặc nếu có bất kỳ yếu tố nào khiến cường độ tín hiệu khó đo lường.

Một số hệ thống sẽ lấy mức phơi nhiễm ban đầu ngắn và sau đó đề xuất mức phơi nhiễm tổng thể dựa trên đó. Các thiết lập nguồn sáng, tiêu điểm và ứng dụng sẽ được người khác tự động chọn.

Điều này có thể giúp việc chụp hình định kỳ diễn ra nhanh hơn, nhưng vui lòng kiểm tra với nhân viên vận hành. Kiểm tra xem:

• Lưu ý: Độ bão hòa được chỉ định cho các dải quan trọng.
• Các dải yếu có thể thấy ở phía trên nền
• Toàn bộ trường quan sát được bao phủ bởi toàn bộ mẫu.
• Để có kết quả tốt nhất, đã sử dụng chế độ hình ảnh phù hợp.
• Bộ lọc và khay cần thiết đã được sử dụng
• Sau đây là phân tích định lượng và yêu cầu bộ đồ phơi sáng:

Cài đặt tự động là điểm khởi đầu tốt, nhưng KHÔNG phải là lý do để không kiểm tra hình ảnh.

Đảm bảo rằng độ phân giải, độ nhạy và góc nhìn đều chính xác

Độ phân giải rất quan trọng đối với hình ảnh được máy ảnh chụp, nhưng số megapixel không phải là chỉ số cho chất lượng hình ảnh của máy ảnh.

Cũng rất quan trọng để có một hệ thống hữu ích đủ nhạy cảm, nền thấp, quang học tốt, đồng nhất và có trường nhìn đủ rộng để chứa các gel hoặc màng dùng trong phòng thí nghiệm.

Nếu tín hiệu phát quang hóa học yếu, sẽ cần một chiếc camera rất nhạy. Khoảng cách giữa các dải càng lớn thì độ phân giải càng giảm; Khoảng cách giữa các dải càng nhỏ và độ phân giải càng quan trọng, và đặc trưng trong mẫu càng nhỏ thì càng cần độ phân giải cao.

Đặt khay gel phòng thí nghiệm lớn nhất, blot hoặc khay đa gel lên vị trí chụp hình trước khi mua. Nếu một loại gel lớn được cắt thành nhiều hình ảnh, sẽ lãng phí công sức và việc so sánh sẽ khó khăn hơn.

Đảm bảo hình ảnh được thu thập một cách nhất quán

Khuyến nghị chụp ảnh trong cùng điều kiện khi so sánh ảnh.

Ghi chế độ hình ảnh, loại nguồn sáng, bộ lọc, thời gian phơi sáng, đã gom lại, lấy nét, vị trí mẫu, cài đặt phân tích, nền và bất kỳ hiệu chỉnh nền nào. Nếu cần, hãy tái sử dụng các giao thức đã được lưu lại.

Nếu nhuộm hoặc mất màu, hãy đảm bảo điều kiện giống nhau đối với gel axit nucleic và protein. Kiểm soát việc tải các mẫu đối chứng, nồng độ kháng thể, thời gian sử dụng chất nền và cách xử lý màng trong các blot phương Tây.

Máy ảnh chỉ có thể ghi lại mẫu mà nó được đặt vào. Nó không thể khắc phục sự chuyển đổi không đều, quá nhiều hậu cảnh, quá tải đường dẫn hoặc thiếu đặc hiệu kháng thể.

Kiểm tra phần mềm phân tích

Các tác vụ phổ biến không nên khó thực hiện với phần mềm phân tích hình ảnh, và phần mềm không nên che khuất quá trình tạo ra kết quả.

Một số hàm thú vị có thể là:

• Phát hiện làn đường & băng tần
• Ước lượng trọng lượng phân tử
• Phép trừ nền
• Đo cường độ băng tần
• Cảnh báo bão hòa
• chuẩn hóa
• Hiển thị kênh đa kênh
• Chú thích hình ảnh
• Xuất dữ liệu
• Khi người dùng hoặc thí nghiệm được ghi lại.

Phân tích tích hợp là lợi thế cho công việc thường xuyên, và phần mềm máy tính để bàn có thể phù hợp hơn cho phân tích chi tiết cũng như chuẩn bị hình ảnh cuối cùng. Ví dụ, các hệ thống chụp ảnh bằng máy đánh cá nhiệt cung cấp khả năng thu thập và phân tích tích tích hợp trên tàu, cùng với quy trình làm việc phần mềm bên ngoài.

Giữ file hình ảnh gốc như thường lệ càng lâu càng tốt. Để điều chỉnh, hình ảnh hiển thị không nên thay thế dữ liệu thu thập thô.

Hãy đảm bảo bạn thực hiện các biện pháp phòng ngừa và thực hiện thêm các bước để đảm bảo mẫu thử của bạn an toàn

Việc cung cấp lớp chắn phù hợp là rất quan trọng vì tia cực tím trực tiếp hoặc phản xạ phát ra từ thiết bị chụp UV có thể gây tổn thương cho mắt và da. Việc phơi nhiễm có thể giảm bằng cách bao quanh buồng chụp ảnh, điều này ít hơn so với hộp đèn UV mở.

Nếu DNA được chiết xuất từ gel, sử dụng kích thích ánh sáng xanh có thể phù hợp hơn cho các vết nhuộm axit nucleic phù hợp. Hình ảnh ánh sáng trắng loại bỏ việc sử dụng tia UV để quan sát các vết nhuộm protein có thể nhìn thấy.

Hệ thống cũng nên được thiết kế để đảm bảo tránh nhiễm khuẩn từ mẫu này sang mẫu khác. Rửa khay mẫu, loại bỏ các vết đổ buffer càng sớm càng tốt và tuân thủ hướng dẫn của nhà sản xuất về việc làm sạch bộ lọc, thấu kính và bề mặt chụp ảnh.

Đảm bảo Hệ thống được thiết lập như một Thiết bị Quang học

Thiết bị chụp ảnh sinh học phân tử không thể chỉ được làm sạch thỉnh thoảng.

Nguồn sáng bị mòn theo thời gian, bộ lọc có thể bị trầy xước, khay mẫu có thể bị ố và bụi có thể ảnh hưởng đến chất lượng hình ảnh. Phòng thí nghiệm nên theo dõi ánh sáng, kiểm tra khay và bộ lọc, sao lưu các quy trình thu thập, cập nhật phần mềm cẩn thận và duy trì tài liệu bảo trì.

Khi chất lượng hình ảnh không tốt, hãy thực hiện toàn bộ quy trình và xem có vấn đề gì với máy ảnh hoặc các bộ phận khác trong chuỗi không. Điều này có thể do màu nhuộm, mẫu hoặc chất nền, cài đặt phơi sáng, nguồn sáng hoặc bộ lọc.

Kết thúc

Nền tảng hữu ích nhất không phải lúc nào cũng là nền tảng có nhiều tính năng nhất. Đây là thiết bị cung cấp ánh sáng, độ nhạy, dải động, phần mềm, khu vực hình ảnh và quy trình làm việc phù hợp mà người dùng khác có thể tái tạo.

Hình ảnh tốt của nó bắt đầu từ giai đoạn chuẩn bị mẫu. Thiết bị ghi lại thí nghiệm, nhưng nếu việc chuẩn bị xét nghiệm được thực hiện cẩn thận và thu thập được lặp đi lặp lại, thì hình ảnh (bản ghi) có ý nghĩa.

Câu hỏi thường gặp

Câu hỏi 1. Hệ thống Hình ảnh Sinh học Phân tử có thể ghi lại điều gì?

Nó có khả năng bắt giữ gel DNA và RNA, gel protein, các khối phát quang phương Tây hóa học, các khối phát quang phương Tây và màng đo màu tùy theo môi trường.

Câu hỏi 2. Sự khác biệt giữa Hệ thống Gel Documentation và Western Blot Imager là gì?

Không phải lúc nào cũng vậy. Hệ thống gel cơ bản có thể chỉ hỗ trợ hình ảnh với tia UV, ánh sáng xanh và trắng, và máy ảnh Western blot có thể cần phát hiện hóa phát quang nhạy hoặc phát hiện huỳnh quang đa kênh.

Câu hỏi 3. Tại sao dải động lại quan trọng? Tại sao dải động lại quan trọng?

Dải động lớn của các tín hiệu sẽ cho phép bắt giữ các tín hiệu yếu và mạnh mà không làm bão hòa tín hiệu mạnh nhất. Điều này đặc biệt đúng với phân tích định lượng.

Câu hỏi 4. Liệu Tự Động Phơi Nhiễm Có Đáng Tin Cậy Không?

Việc xác định phạm vi phơi nhiễm ban đầu có thể hữu ích. Người vận hành cũng nên quan sát các yếu tố khác như bão hòa, nền, tín hiệu yếu và chế độ chụp ảnh.

Câu hỏi 5. Chế độ Imaging Mode nào là tốt nhất?

Chế độ sử dụng phụ thuộc vào mẫu, màu nhuộm, nhãn và mục tiêu phân tích. Nguồn sáng, bộ lọc và cài đặt camera phụ thuộc vào phương pháp xét nghiệm.